提高釀酒酵母濃醪發(fā)酵乙醇產(chǎn)量的研究.pdf

1、燃料乙醇是目前應(yīng)用最為廣泛的生物燃料,然而原料成本過高是導(dǎo)致目前燃料乙醇行業(yè)利潤較低的主要因素。盡管濃醪發(fā)酵技術(shù)的使用降低了生產(chǎn)能耗、提高了裝備的利用率,但這對乙醇發(fā)酵菌種也帶來了更大的挑戰(zhàn),如何在高糖濃度下快速生長發(fā)酵、在高乙醇濃度下徹底消耗葡萄糖以及進(jìn)一步提高糖-醇轉(zhuǎn)化率和乙醇終濃度,是目前釀酒酵母乙醇發(fā)酵菌種改造需要解決的關(guān)鍵問題。
　　以菌株FTG2為基礎(chǔ),通構(gòu)建一系列GPD1啟動(dòng)子3’端序列部分缺失的突變株以降低GPD1

2、基因的表達(dá),在不影響菌株濃醪發(fā)酵速度的前提下提高糖-醇轉(zhuǎn)化率。研究發(fā)現(xiàn),隨著GPD1啟動(dòng)子缺失長度的增加,GPD1基因的表達(dá)逐漸減弱,缺失長度大于等于100bp時(shí)菌株對滲透壓抗性明顯降低,分別缺失60和80bp的菌株LE34U和LE35U,甘油產(chǎn)量分別比KAM-2U降低27.13％和40.90%,最終乙醇濃度分別提高3.89%和4.49%,糖-醇轉(zhuǎn)化率為0.466和0.470g/g,均優(yōu)于FTG2U(乙醇濃度提高3.06%,糖-醇轉(zhuǎn)化率

3、0.462g/g),而發(fā)酵速度沒有明顯降低。
　　為進(jìn)一步提高LE34U和LE35U的乙醇產(chǎn)量,進(jìn)行了以下研究:
　　1.缺失編碼乙醇脫氫酶的ADH2基因,使LE34U、LE35U的最終乙醇濃度分別上升0.72%和0.61%,糖-醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.469和0.477g/g;
　　2.將LE34U和LE35U轉(zhuǎn)變成雙倍體以提高菌株對不利環(huán)境的適應(yīng)能力,結(jié)果雙倍體菌株發(fā)酵速度無明顯提高而乙醇產(chǎn)量有所下降;
　　3.在培

4、養(yǎng)基中外加甘油對LE34U和LE35U的發(fā)酵速度和乙醇產(chǎn)量沒有影響;
　　4.培養(yǎng)基外加乙酸濃度小于等于3g/L時(shí)對發(fā)酵有促進(jìn)作用;而乙酸濃度大于等于4g/L時(shí)對LE34U和LE35U產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制,但是對KAM-2U抑制作用較小;
　　5.以FTG2G1U為出發(fā)菌株在高糖濃度培養(yǎng)基中馴化,生長速度明顯改善后部分恢復(fù)GPD1基因的表達(dá)(啟動(dòng)子部分缺失),結(jié)果菌株在GPD1啟動(dòng)子3’端缺失100bp時(shí)生長和代謝得到改善,而缺失8

5、0bp時(shí)菌株的甘油產(chǎn)量比未經(jīng)馴化菌株降低約33%;乙醇濃度最高菌株分別比對照提高5.39%和5.16%,糖-醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.477和0.478g/g,但生長和代謝減慢。
　　建立了一種以化學(xué)誘變和染色體有性重組為基礎(chǔ)的釀酒酵母進(jìn)化工程新方法。從ste2基因缺失的釀酒酵母雙倍體菌株W303D出發(fā),誘變后高效生孢使突變基因組合并分離,經(jīng)過一輪篩選得到乙醇產(chǎn)量提高的重組菌株WS1和WS5。該重組菌株在高葡萄糖或乙醇濃度的平板上生長能力顯