釀酒酵母遺傳操作降低甘油合成提高乙醇產(chǎn)量的研究.pdf

1、本博士論文基于代謝工程理念，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對釀酒酵母進行遺傳操作，分別缺失了編碼甘油通道蛋白基因FPS1、編碼三磷酸甘油脫氫酶基因GPD1和GPD2，目的是降低釀酒酵母甘油的生成量、增加胞內(nèi)甘油積累，提高乙醇產(chǎn)量；同時，在構(gòu)建的基因工程菌株中過量表達編碼谷氨酸合酶基因GLT1，克服由于甘油通道蛋白基因FPS1與三磷酸甘油脫氫酶基因GPD缺失后所造成的細胞內(nèi)氧化還原不平衡問題。本研究采用了一步基因置換法在出發(fā)菌株中分別缺失了FPS1、

2、GPD1、GPD2，采用兩步基因置換法構(gòu)建了GLT1過量表達的菌株。然后將上述構(gòu)建的單倍體菌株之間進行雜交產(chǎn)生α/a型的雙倍體細胞，在特定的條件下使其產(chǎn)生有性孢子-子囊孢子，通過四分體拆分獲得了10株不同遺傳型的重組菌株。在厭氧的條件下對10株重組菌株進行分批間歇厭氧發(fā)酵，對它們的發(fā)酵特性進行分析。 研究結(jié)果表明，重組菌株KAM-9(fps1△：：REPEAT gpd2△：：REPEAT)的生長速率和葡萄糖的消耗速率略低于出發(fā)菌

3、株KAM-2，而KAM-13(gpd2△：：REPEAT PGK1-GLT1)重組菌株的生長速率和葡萄糖消耗速率與出發(fā)菌株KAM-2比較沒有明顯差異，表明GLT1過量表達緩解了KAM-9菌株中的還原力失衡的問題；兩株重組菌株的甘油生成量分別比出發(fā)菌株KAM-2降低了31.40％和36.22％，乙醇產(chǎn)量則分別比出發(fā)菌株提高了12.00％和15.56％；同時，與出發(fā)菌株KAM-2相比較，所有的重組菌株的乙酸和丙酮酸合成能力均有大幅度地下降；

4、在KAM-10(gpd1△：：REPEAT gpd2A::REPEAT)重組菌株中同時缺失GPD1、GPD2基因后，由于甘油合成的徹底阻斷導(dǎo)致酵母細胞內(nèi)的氧化還原出現(xiàn)嚴(yán)重的不平衡，菌株生長和葡萄糖利用緩慢，最終影響到乙醇的產(chǎn)量。本文建立了S.cerevisiae基因工程菌株的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)及計量學(xué)和通量平衡模型，分析了基因GPD2缺失與過量表達基因GLT1前后兩株酵母菌株在厭氧條件下發(fā)酵的代謝通量分布。結(jié)果表明：基因工程菌株KAM-13底