降低乙醇和乙酰CoA生物合成對釀酒酵母異丁醇產(chǎn)率的影響.pdf

1、異丁醇作為一種新型的生物燃料，已經(jīng)受到學術(shù)界和工業(yè)界人士的關(guān)注。異丁醇比乙醇有更高的辛烷值和能量密度。另外，異丁醇與汽油具有相似的吸收性、能量密度和辛烷值，可在現(xiàn)有的基礎(chǔ)設(shè)施中使用。目前，多數(shù)微生物對醇類有較低的耐受性，異丁醇的產(chǎn)率很難大幅度提高。但是，釀酒酵母發(fā)酵合成乙醇已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)，對醇類有很高的耐受性，并且，釀酒酵母在酸性環(huán)境下具有穩(wěn)定性和耐受性。釀酒酵母作為細胞工廠的研究平臺，基因測序已經(jīng)完成，擁有比較成熟的DNA重組技術(shù)。因

2、此，可以通過DNA重組技術(shù)改進釀酒酵母生產(chǎn)異丁醇的能力。
　　本研究以實驗室保藏的釀酒酵母W303-1A為出發(fā)菌，通過DNA重組技術(shù)，構(gòu)建釀酒酵母合成異丁醇的研究平臺，提高釀酒酵母發(fā)酵異丁醇的產(chǎn)率。根據(jù)釀酒酵母生物合成異丁醇的代謝途徑和前體丙酮酸代謝去向分析，分別通過以下四種途徑來研究：第一，利用兩步基因置換法過量表達編碼分枝氨基酸轉(zhuǎn)氨酶 BAT2，提高異丁醇合成通量。第二，利用一步基因置換法缺失編碼內(nèi)源性的丙酮酸脫羧酶PDC6，

3、減少乙醇的生物合成。第三，利用一步基因置換法缺失編碼二氫硫辛酸脫氫酶LPD1，減少丙酮酸合成乙酰CoA。第四，利用構(gòu)建的表達質(zhì)粒 YEplac181-PGK1p-ILV2和YEplac195-ILV3p-PGK1p-ILV3，過量表達編碼乙酰乳酸合酶的ILV2和2-羥異戊酸脫水酶ILV3，提高纈氨酸代謝通量。其中，突變株HZAL-2(PGK1p-BAT2)中過量表達了BAT2；突變株HZAL-7(PGK1p-BAT2 pdc6::R)中

4、過量表達了BAT2，缺失了PDC6；突變株HZAL-12(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR)中過量表達了BAT2，缺失了LPD1；突變株HZAL-11(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR pdc6::R)中過量表達了 BAT2，缺失了 LPD1和PDC6。
　　經(jīng)過基因修飾后的釀酒酵母菌進行厭氧發(fā)酵試驗。突變株HZAL-7(PGK1p-BAT2 pdc6::R)[YEplac181-PGK1p-ILV2/YEpl

5、ac195-ILV3p-PGK1p-ILV3]，相對于對照菌株異丁醇的產(chǎn)率提高11.4倍。而突變株 HZAL-12(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR)[YEplac181-PGK1p-ILV2]相對于對照菌株異丁醇的產(chǎn)率提高8.8倍；缺失PDC6基因的突變株HZAL-11(PGK1p-BAT2 pdc6::R)[YEplac181-PGK1p-ILV2]相對于對照菌株異丁醇產(chǎn)率提高13.6倍。
　　結(jié)果表明：通過DNA重