木糖轉(zhuǎn)化乙醇代謝途徑在釀酒酵母工業(yè)菌株中的建立.pdf

1、該文通過(guò)敏感度實(shí)驗(yàn)測(cè)定了G418和Cu<'2+>作用于三株釀酒酵母工業(yè)菌株SK-1、SPSC-1、NAN-27的最低抑菌濃度,發(fā)現(xiàn)三株菌對(duì)G418的敏感性差別很大,G418作用于SPSC-1酒精酵母的最低抑菌濃度達(dá)到750μg/ml,對(duì)SK-1釀酒酵母的最低抑菌濃度只有100μg/ml.同株菌在不同的培養(yǎng)基上對(duì)銅離子的耐受性相差也很大,SPSC-1酒精酵母在YEPD培養(yǎng)基上可以耐受15mmol/L Cu<'2+>,但在YNB基本培養(yǎng)基上

2、只可以耐受1mmol/L Cu<'2+>.對(duì)工業(yè)菌株釀酒酵母進(jìn)行醋酸鋰法轉(zhuǎn)化的系列條件做了研究,確定OD<,600>值0.8-1.0時(shí)是最佳細(xì)胞收獲時(shí)間,轉(zhuǎn)化子先在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6h再涂布G418選擇平板可以大大提高轉(zhuǎn)化子的數(shù)量.通過(guò)改進(jìn)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,使含銅抗性基因的質(zhì)粒KB806成功轉(zhuǎn)入工業(yè)酵母菌株SPSC-1和NAN-27中,初步解決了工業(yè)菌株轉(zhuǎn)化難的問(wèn)題.在真菌中,木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的反應(yīng)是在依賴NADPH的木糖還原酶(xyl

3、ose reductase, XR)作用下,將木糖還原為木糖醇,然后在依賴NAD的木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH)作用下,轉(zhuǎn)化木糖醇為木酮糖.接著木酮糖經(jīng)木酮糖激酶(xylulokinase, XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖,這步酶促反應(yīng)是木糖代謝的限速步驟之一.因此我們將來(lái)自畢赤氏酵母Pichia stipitis的木糖還原酶基因(XYL1)、木糖醇脫氫酶基因(XYL2)和釀酒酵母自身的木酮糖激酶基

4、因(XKS1)連接到已構(gòu)建的單拷貝整合載體pYIK和多拷貝整合載體pYMIK上.PGK和ADH1啟動(dòng)子均為釀酒酵母組成型強(qiáng)啟動(dòng)子,而PGK啟動(dòng)子的表達(dá)效力比ADH1啟動(dòng)子強(qiáng).將XYL1基因置于乙醇脫氫酶啟動(dòng)子ADH1控制下,將XYL2基因置于磷酸甘油激酶啟動(dòng)子PGK控制下,從而控制木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的表達(dá)量,減少因木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的輔酶不能相偶聯(lián),細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡所致的木糖發(fā)酵中的木糖醇積累.XKS1基因置于磷酸甘油

5、激酶啟動(dòng)子PGK控制下.得到重組質(zhì)粒pYIK-123和pYMIK-127.將所構(gòu)建釀酒酵母重組菌在氧氣限量的條件下,進(jìn)行木糖葡萄糖共發(fā)酵實(shí)驗(yàn).重組菌的生長(zhǎng)情況和宿主菌沒(méi)有明顯區(qū)別,表明外源基因的引入對(duì)重組菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響.發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果表明各重組菌都能利用木糖產(chǎn)生乙醇.其中,以釀酒酵母工業(yè)菌株為宿主菌,多拷貝整合木糖還原酶(XR)基因、木糖醇脫氫酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)基因的釀酒酵母重組菌NAN-127利用木糖生

6、產(chǎn)乙醇的效果最優(yōu).對(duì)木糖的利用最高可達(dá)18.4g/L,較宿主菌提高了2倍,乙醇產(chǎn)量最高可達(dá)7.9g/L,較宿主菌提高39﹪.由此在釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株和工業(yè)菌株中分別建立了細(xì)菌和真菌的兩條木糖代謝途徑.經(jīng)過(guò)比較,發(fā)現(xiàn)由rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合木糖代謝酶基因的重組菌對(duì)木糖的利用和乙醇的產(chǎn)生都高于單拷貝整合木糖代謝酶基因的重組菌.并且以釀酒酵母工業(yè)菌株為宿主菌的重組菌對(duì)木糖的利用和乙醇的產(chǎn)生高于以實(shí)驗(yàn)室菌株為宿主菌的重組菌,乙醇的產(chǎn)生速度也較