共表達(dá)木糖代謝酶基因重組釀酒酵母的構(gòu)建及發(fā)酵研究.pdf

1、木糖是木質(zhì)纖維素中最重要的五碳糖組分,也是自然界僅次于葡萄糖的第二大糖源。木糖的有效利用是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前已發(fā)現(xiàn)的自然界存在的微生物菌株仍然不能滿足商業(yè)化生產(chǎn)的需要。天然的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能有效利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇,但是不具備利用木糖的能力。利用新的技術(shù)和手段對(duì)酵母菌進(jìn)行改造,提高其對(duì)木糖的發(fā)酵能力成為目前研究和開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。
　　本研究通過(guò)基因工程的手段,

2、將實(shí)驗(yàn)室已克隆得到的五個(gè)木糖代謝基因串聯(lián)拼接至表達(dá)載體后引入釀酒酵母中,構(gòu)建一株共發(fā)酵木糖和葡萄糖產(chǎn)生乙醇的重組工程菌。首先,利用融合PCR技術(shù)將來(lái)自近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)的木糖還原酶基因(xyl1),熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脫氫酶基因(xyl2),樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)的木酮糖激酶基因(xks1),以及釀酒酵母內(nèi)源的轉(zhuǎn)醛酶基因(tal1)和

3、轉(zhuǎn)酮酶基因(tkl1)進(jìn)行拼接,得到了xyl1-xyl2-tal1(X12A)與xks1-tkl1(SK)連接片段。經(jīng)過(guò)雙酶切驗(yàn)證和T4連接反應(yīng),將獲得的拼接片段克隆到釀酒酵母附加型質(zhì)粒pAUR123載體上,成功構(gòu)建了質(zhì)粒 pAUR123-X12A( xyl1-xyl2-tal1)、pAUR123-SK(xks1-tkl1)。其次,以重組質(zhì)粒pAUR123-X12A、pAUR123-SK為模版,設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物,克隆出含有酶切位點(diǎn)

4、的X12A與SK基因片段,經(jīng)過(guò)雙酶切及T4連接反應(yīng),以釀酒酵母附加型質(zhì)粒pAUR123為載體,成功構(gòu)建了含有xyl1、xyl2、tal1基因的質(zhì)粒 pAUR123-X12A和含有xyl1、xyl2、tal1、xks1、tkl1基因的質(zhì)粒pAUR123-XL(xyl1-xyl2-tal1-xks1-tkl1簡(jiǎn)寫(xiě)為XL),采用乙酸鋰轉(zhuǎn)化法對(duì)釀酒酵母INVSC1菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化,通過(guò)抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆。利用分子生物學(xué)手段對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行檢測(cè)并獲得含

5、有重組質(zhì)粒的工程菌S.c INVSC1-X12A和S.c INVSC1-XL。通過(guò)對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè),確定構(gòu)建工程菌能同時(shí)表達(dá)已導(dǎo)入的木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因、木酮糖激酶基因、轉(zhuǎn)醛酶基因和轉(zhuǎn)酮酶基因,進(jìn)而通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)表明每種酶均具有一定活性,為木糖代謝研究提供了種質(zhì)資源。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證重組菌對(duì)木糖利用情況,將重組菌 S.c INVSC1-X12A和 S.c INVSC1-XL在以6％木糖為單一碳源進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)重組菌能

6、利用木糖,木糖的利用率分別為74.8%和79.5%,乙醇得率分別為31.14%和39.88%。在以不同配比的葡萄糖/木糖混和糖限氧培養(yǎng)基發(fā)酵條件下,重組菌的最佳的葡萄糖/木糖混和比為5:1,發(fā)酵時(shí)間為60h,此時(shí)S.c INVSc1-X12A乙醇得率為74.85%,糖利用率為96.61%,S.c INVSc1-XL乙醇得率為76.92%,糖利用率為96.78%。這表明,轉(zhuǎn)入的近平滑假絲酵母的木糖還原酶基因,熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因