肺炎克雷伯氏桿菌利用甘油產(chǎn)3-羥基丙酸的代謝工程研究.pdf

1、平臺化合物3-羥基丙酸（3-Hydroxypropionic acid，3-HP）因其良好的化學變通性近年來受到了極大的關注。傳統(tǒng)的化學法生產(chǎn)3-羥基丙酸因環(huán)境污染大、成本高等因素，制約了該化合物的廣泛使用。近來，生物法從甘油合成3-羥基丙酸因其良好的環(huán)境兼容性及低成本的底物價格優(yōu)勢，成為未來生產(chǎn)3-羥基丙酸工業(yè)化生產(chǎn)的可行道路。肺炎克雷伯氏桿菌因其較快的生長速度及較高的甘油耐受性，成為了3-羥基丙酸生產(chǎn)的首選宿主菌。本研究針對肺炎克雷

2、伯氏桿菌進行了一系列代謝工程的改造，使其3-羥基丙酸的生產(chǎn)能力得到了大幅度提升，同時也對該平臺菌種進行了基礎研究，完善了該非模式菌中的分子操作技術，主要包括以下內(nèi)容。
　　1、針對3-HP生產(chǎn)中的兩個關鍵酶甘油脫水酶(GDHt)和醛脫氫酶(ALDH)的酶活差異導致的生產(chǎn)不平衡性，在K.pneumoniae中構建三種載體，將兩者的編碼基因dhaB和ald4用三種不同的方式進行連接，即dhaB優(yōu)先表達、ald4優(yōu)先表達及兩基因分別用各

3、自的啟動子同時表達。結果發(fā)現(xiàn)，搖瓶中優(yōu)先表達ald4的重組K.pneumoniae的3-HP產(chǎn)量最高，在24 h達2.14 g/L，相比于其他兩株菌，該菌ALDH酶活為最高，為35.16 U/mg，而GDHt酶活最低。該結果表明，平衡后的表達方式增加了3-HP生產(chǎn)能力，減少了中間產(chǎn)物的積累。接著測試了來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的ald4、來自E.coli的aldH和來自K.pneumoniae的puuC

4、基因編碼的ALDH在K.pneumoniae中的催化活性。結果表明，puuC基因編碼的ALDH具有較高的活性，其酶活達到了50.35 U/mg。工程菌K.pneumoniae(PB-puuC)在搖瓶中的3-HP產(chǎn)量達到7.21 g/L，5L發(fā)酵罐中達到20g/L，展現(xiàn)出了較大的生產(chǎn)潛力。
　　2、為了提高ALDH在K.pneumoniae中的酶活，在K.pneumoniae中進行了再生NAD+的研究。尋找了來自S.cerevisi

5、ae中甘油3-磷酸脫氫酶編碼基因GPD1、來自K.pneumoniae中NADH脫氫酶編碼基因nadh及來自K.pneumoniae中NADH氧化酶編碼基因naox體內(nèi)表達催化NADH變?yōu)镹AD+。結果表明，NADH氧化酶有著最高的NAD+再生活性，其酶活達到57 U/mg。構建含有NAD+再生及ALDH共表達載體的K.pneumoniae后，重組菌Kp(NALD)展現(xiàn)出活性最高的NAD+再生活力，達到40.84 U/mg，且相應的AL

6、DH活性也有了較大提高，達55.51 U/mg。但發(fā)酵結果顯示，含有NADH氧化酶載體的重組Kp(OXLD)的3-HP產(chǎn)量最高，24 h時達2.12 g/L，且由于輔酶的操控，該重組菌的生物量比對照組提高了8％，OD600達到了1.5。本實驗通過體內(nèi)調(diào)節(jié)輔酶比例，調(diào)整了代謝流的流向及生物量的積累，且尋找到了副反應最小的NADH氧化酶為后續(xù)提升產(chǎn)量奠定了基礎。
　　3、依照假單胞菌Pseudomonas sp.AIU362中編碼NA

7、D+不依賴型的醛氧化酶AOX基因序列人工合成了888 bp的alod基因，連接至pET-28a和pET-pk載體上，分別轉(zhuǎn)化至E.coli及K.pneumoniae中表達。SDS-PAGE顯示AOX在兩宿主菌內(nèi)均得到了較好表達。經(jīng)測定，AOX對正丙醛及3-羥基丙醛(3-HPA)的酶活分別達到了16.6U/mg及13.7 U/mg，初步證明了AOX催化3-HPA合成3-HP的可能性。經(jīng)雙倒數(shù)法測定，AOX對3-羥基丙醛的Km值和Vmax值

8、分別達到了6.68 mM和41.8μ mol/min/mg。分子模擬結果顯示其與ALDH存在著較大的結構上的差異。重組菌K.pneumoniae(pk-alod)的搖瓶發(fā)酵結果顯示，3-HP產(chǎn)量在24 h達到0.85 g/L，對照組為0.6 g/L。后續(xù)上罐發(fā)酵中，K.pneumoniae(pk-alod)的3-HP產(chǎn)量在24 h達到3 g/L。這是國內(nèi)外首次使用NAD+獨立型醛氧化酶進行3-HP的生產(chǎn)。
　　4、利用合成生物學中

9、的MAGE技術，對非模式菌種K.pneumoniae進行了大規(guī)模的基因組改造。首先構建了外源穩(wěn)定表達λRed系統(tǒng)重組酶的質(zhì)粒pET-Red及敲除K.pneumoniae乳酸脫氫酶基因的載體pET-ud-ldh，分別使用Red系統(tǒng)及RecA系統(tǒng)敲除了dhaT基因及l(fā)dh基因，并在dhaT基因的位置上用aldH基因代替，構建了平臺工程菌Kpac。利用Kpac為宿主進行了單鏈介導的重組，重構了多于30條甘油相關代謝途徑。最終篩選了201株菌進

10、行3-HP產(chǎn)量的測定，篩選出一株3-HP產(chǎn)量最高的宿主菌，并命名為Kp3。經(jīng)酶活檢測，Kp3的ALDH、GDHt和PDOR的酶活分別達到3.83 U/mg、11.17 U/mg和3.94 U/mg，均高出K.pneumoniae及Kpac。測序結果顯示Kp3的突變發(fā)生在另一個ldh基因和poxB基因上，編碼了3-HP生產(chǎn)中產(chǎn)生副產(chǎn)物乳酸及乙酸的關鍵酶。在無抗生素及誘導劑加入的情況下，Kp3在搖瓶中3-HP產(chǎn)量可達到0.6 g/L，在5L

11、發(fā)酵罐中3-HP產(chǎn)量達6.39 g/L。之后測試并利用反義mRNA技術抑制了K.pneumoniae中的乳酸及乙酸的代謝流，并同時引入了aldH基因以提升3-HP的合成能力。結果表明，相對于只表達aldH的Kp(pET-aldH)，引入乳酸和乙酸的反義模塊的重組菌Kp(pET-rLB-aldH)乳酸及乙酸的產(chǎn)量有了明顯的降低，同時該重組菌3-HP產(chǎn)量得到了提高。該現(xiàn)象說明3-HP的生產(chǎn)與副產(chǎn)物乳酸乙酸的生成為相互競爭的關系，并未后續(xù)提高

12、3-HP的產(chǎn)量提供了思路。
　　5、為了提高K.pneumoniae的3-HP生產(chǎn)能力，對重組K.pneumoniae進行了組合優(yōu)化。尋找了組成型的lac啟動子及誘導性的tac啟動子，分別連接在pUC19及pET-28a載體上，表達K.pneumoniae自身的puuC基因，構建了重組菌K.pneumoniae(puck-puuC)和K.pneumoniae(ptac-puuC)。利用組成型產(chǎn)3-HP的菌種K.pneumoniae

13、(puck-puuC)優(yōu)化了甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，最佳成分為K2HPO4·3H2O5.1 g/L,KH2PO41.95 g/L,(NH4)2 SO48g/L,MgSO4·7H2O0.125 g/L，酵母粉4 g/L。利用誘導性3-HP生產(chǎn)菌K.pneumoniae(ptac-puuC)優(yōu)化了IPTG濃度和發(fā)酵pH值，最終分別確定為0.02 mM及pH7。搖瓶發(fā)酵測定兩株工程菌的代謝流量，發(fā)現(xiàn)在tac啟動子的作用下，重組菌K.pneumonia

14、e(ptac-puuC)減少了1，3-丙二醇及2，3-丁二醇的代謝流量，同時增加了3-HP的代謝流量，其3-HP產(chǎn)量達2.93 g/L。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下經(jīng)過精細的發(fā)酵調(diào)控，重組菌的3-HP產(chǎn)量達到73.4 g/L，甘油轉(zhuǎn)化率達到52％，在副產(chǎn)物乳酸及乙酸有了較大幅度降低的同時，高值化合物1，3-丙二醇及2，3-丁二醇也有17.9 g/L和20g/L的產(chǎn)生，為聯(lián)產(chǎn)高價值化合物提供了良好的基礎。為進一步增加3-HP產(chǎn)量，同時減少乳酸及乙

15、酸的產(chǎn)量，利用RecA重組技術構建了3個打靶載體，敲除了ldh、lldd及pta基因，得到宿主菌KpF。將tac-puuC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，得到重組菌KpF(ptac-puuC)。上罐發(fā)酵結果顯示，該重組菌在72 h內(nèi)3-HP合成量達到了83.8 g/L，甘油轉(zhuǎn)化率達54％，同時有著較少的乳酸和乙酸的產(chǎn)生，展現(xiàn)出了極大的工業(yè)化生產(chǎn)前景。Real-Time PCR分析結果顯示，誘導tac啟動子后，K.pneumoniae自身的RNA聚合酶及其相關