重組克雷伯氏菌生產(chǎn)3-羥基丙酸與發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、3-羥基丙酸（3-HP）是一種重要的平臺化合物，可以被用來合成多種重要的化合物，具有十分廣泛的應(yīng)用前景。近些年伴隨著生物柴油工業(yè)大量生產(chǎn)，甘油價格日漸下降。若能得到一株可以高效利用甘油催化生產(chǎn)3-HP的菌株，將會產(chǎn)生巨大的環(huán)境與經(jīng)濟(jì)效益。本論文為了實(shí)現(xiàn)利用重組克雷伯氏菌發(fā)酵合成3-HP，開展了以下研究。
　　PCR擴(kuò)增Cupriavidus necator GabD4和Azospirillum brasilense KGSADH醛

2、脫氫酶基因，分別與獲得卡那霉素(Kanamycin)抗性的pUC19質(zhì)粒(pUC19Kan)連接，導(dǎo)入宿主菌Klebsiella pneumoniae DSM2026。通過搖瓶發(fā)酵，比較重組菌KpKan/KGSADH與KpKan/GabD4的發(fā)酵性能。結(jié)果證明，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的最高3-HP產(chǎn)量分別為3.66與2.56g/L，最終選擇產(chǎn)量較高的KpKan/KGSADH重組菌進(jìn)行后續(xù)研究。
　　通過搖

3、瓶單因素實(shí)驗(yàn)，詳細(xì)優(yōu)化重組菌KpKan/KGSADH的底物濃度、酵母膏濃度、初始pH、裝液量與接種量等影響因素。獲得最優(yōu)條件為:30g/L甘油、4g/L酵母膏、初始pH7.0、2％接種量、250mL搖瓶裝125mL發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)化后的3-HP的最高產(chǎn)量為3.81g/L。在此基礎(chǔ)上，搖瓶發(fā)酵過程中兩次調(diào)節(jié)pH至7.0，3-HP的最高產(chǎn)量可達(dá)11.2g/L。
　　在5L發(fā)酵罐中，運(yùn)用上述優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，以分段調(diào)控pH的方式進(jìn)行發(fā)酵，

4、3-HP的產(chǎn)量最高達(dá)到11.9g/L;采用實(shí)時調(diào)控pH的方式進(jìn)行發(fā)酵，3-HP的產(chǎn)量最終到達(dá)13.4g/L。最后，在實(shí)時調(diào)控pH的基礎(chǔ)上，分別在發(fā)酵12h與40h補(bǔ)充60g甘油，3-HP的產(chǎn)量最終達(dá)到本研究最高的15.1g/L。
　　本論文首次將C.necator GabD4的醛脫氫酶基因?qū)隟lebsiella pneumoniae DSM2026構(gòu)建重組菌。同時，詳細(xì)對比了KpKan/KGSADH與KpKan/GabD4的產(chǎn)3