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1、3-羥基丙酸(3-HP)是一種重要的平臺(tái)化合物,其生物合成方法與工業(yè)化程度引起了廣泛的重視。本文選取具有高濃度甘油耐受力的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)作為3-HP的生產(chǎn)宿主,以K.pneumoniae的組成型啟動(dòng)子分別構(gòu)建了醛脫氫酶基因ald4與甘油脫水酶基因dhaB的串聯(lián)共表達(dá)質(zhì)粒pKP-28a-AB,經(jīng)SDS-PAGE分析,重組菌的關(guān)鍵酶基因得以有效表達(dá)。搖瓶批式發(fā)酵顯示,重組菌K. pneumoni
2、ae(pKP-28a-AB)在有氧條件下,3-HP產(chǎn)量為0.336 g·L-1,甘油轉(zhuǎn)化率為0.1(mol·mol-1 glycerol)。
以關(guān)鍵酶共表達(dá)質(zhì)粒pKP-28a-AB,分別轉(zhuǎn)化1,3-丙二醇高產(chǎn)菌株K.pneumoniae K2與乳酸脫氫酶基因敲除菌株K. pneumoniae Kp5-3,獲得的重組菌K2-AB與Kp5-3-AB經(jīng)初步發(fā)酵分析顯示,重組菌K2-AB在小試條件下的3-HP產(chǎn)量為3.09 g·L
3、-1,甘油轉(zhuǎn)化率為0.68(mol·mol-1 glycerol),相比已構(gòu)建的重組菌具有最高的3-HP生成量;重組菌Kp5-3-AB的搖瓶批式發(fā)酵結(jié)果顯示,3-HP濃度相比對(duì)照菌株提高了~1倍,乳酸濃度降低了~1倍。
建立了兩種消除K. pneumoniae重組型質(zhì)粒的方法:連續(xù)傳代法與SDS法。其中,用0.2%SDS復(fù)合Ca2+處理K. pneumoniae,能有效消除其重組型質(zhì)粒,獲得的質(zhì)粒消除菌可再次導(dǎo)入新的質(zhì)粒。
4、利用建立的質(zhì)粒消除方法,初步研究了抗性脅迫條件對(duì)重組菌生產(chǎn)3-HP的影響,發(fā)酵分析顯示,新構(gòu)建的重組菌3-HP生成量相比同基因型的對(duì)照菌株提高了24.57%。
利用合成生物學(xué)領(lǐng)域新興的應(yīng)用,設(shè)計(jì)了構(gòu)建“細(xì)胞工廠”的五個(gè)通用研究步驟。將DNA組裝技術(shù)引入實(shí)驗(yàn),以Polymerase cycling assembly(PCA)的方法研究質(zhì)粒構(gòu)建的問題,并依靠?jī)蓚€(gè)線性DNA片段構(gòu)建出~4.5kb的完整質(zhì)粒,為實(shí)現(xiàn)快速有效的非連接
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