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文檔簡介
1、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumonia),嗜肺巴氏桿菌(Pasteurela pneumotropica)是實驗動物特別是大小鼠的常見病原菌;實驗動物感染后將對實驗結(jié)果造成影響。我國實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定:無特定病原體(SPF)動物必須無此類細(xì)菌感染。當(dāng)今對于這兩種細(xì)菌的檢測主要是分離培養(yǎng)法,該方法因靈敏度低有待改進(jìn)?;谔禺愋钥乖难鍖W(xué)檢測方法擁有靈敏度高,特異性強(qiáng),成本低,速度快,感染后恢復(fù)期的動物也能檢出等特點
2、,是實驗動物病原感染檢測優(yōu)選方法。
我們在對肺炎克雷伯桿菌特異性抗原的研究中,采用甲醛滅活的10種小鼠常見病原菌菌體免疫小鼠制備多克隆抗體,使用雙向電泳分離肺炎克雷伯桿菌的總蛋白,并以免疫印跡法(western blotting)與肺炎克雷伯桿菌多克隆抗體反應(yīng),篩選出免疫原性強(qiáng)的蛋白抗原;再將細(xì)菌總蛋白與其他多克隆抗體反應(yīng)來排除交叉抗原。篩選出的特異性抗原蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過以上方法,發(fā)現(xiàn)在western blottin
3、g反應(yīng)中,有一個蛋白呈現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性和靈敏度,經(jīng)質(zhì)譜鑒定為酸性磷酸酶(Acid phosphatase,Gi:238894261)蛋白。
在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中查詢該蛋白的編碼序列,設(shè)計引物擴(kuò)增該基因,構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)蛋白經(jīng)純化后,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對靈敏度和特異性進(jìn)行驗證,以陽性反應(yīng)吸光度的平均值(A值)與交叉反應(yīng)的A值之比確定信噪比。結(jié)果顯示,該蛋白信噪比可達(dá)3.25,證明酸性磷
4、酸酶為肺炎克雷伯桿菌的特異性抗原蛋白。
嗜肺巴氏桿菌由于不能查到其基因組信息,嘗試從其親緣關(guān)系最近的菌種多殺巴氏桿菌中篩選特異性抗原。使用多殺巴氏桿菌總蛋白與嗜肺巴氏桿菌多抗反應(yīng)篩選高靈敏度抗原,而與其他細(xì)菌多抗反應(yīng)排除交叉抗原。結(jié)果顯示,hypothetical proteinPM1693(Gi:15603558)呈現(xiàn)出較強(qiáng)的特異性和靈敏度,信噪比2.36,又由于小鼠不易感染多殺巴氏桿菌,該蛋白有望作為小鼠嗜肺巴氏桿菌檢
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