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文檔簡介
1、兔波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)和巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)是引起兔呼吸道傳染病的主要致病菌,臨床上這兩種菌有時呈現(xiàn)混合感染,由于它們在菌落形態(tài)、臨床癥狀以及病理變化等方面都存在許多相似的地方,僅靠表面癥狀容易造成誤診,所以建立一種操作簡便、快速靈敏和特異性強的檢測方法顯得十分必要。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplifica
2、tion,LAMP)技術是Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的核酸擴增技術,通過一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用,在恒溫條件下高效、快速、特異地擴增靶基因,不需要PCR的熱循環(huán)步驟和繁瑣的電泳檢測過程,為病原在臨床上的快速診斷提供了全新的思路。
本研究針對Bb16S rRNA基因和Pm Kmt1基因,使用在線設計軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.
3、0/index.html)設計LAMP引物,然后分別對反應溫度和時間、dNTPs濃度、Mg2+濃度、Betaine濃度、Bst DNA Polymerase濃度以及引物濃度進行了優(yōu)化,建立了LAMP反應體系。
本研究利用LAMP技術對8株兔源性細菌分別進行Bb和Pm的特異性試驗,結(jié)果顯示僅有目標菌株為陽性,其余7株細菌均為陰性,表明LAMP檢測技術具有良好的特異性。
本研究采用Qiagen試劑盒法制備模板進行LAMP
4、反應,該方法檢測Bb和Pm的檢出限分別為1.65CFU/mL和1.29CFU/mL,而對照PCR檢測Bb和Pm的檢出限分別為165CFU/mL和129CFU/mL,表明LAMP技術的靈敏度為普通PCR的100倍。
本研究用已優(yōu)化的LAMP檢測方法分別對15份Bb陽性樣品和10份Pm陽性樣品進行穩(wěn)定性與重復性試驗,檢測結(jié)果均為陽性,表明該方法具有良好的穩(wěn)定性與重復性。
本研究比較了3種基因組DNA提取方法對LAMP檢測
5、結(jié)果的影響,研究結(jié)果表明LAMP方法對制備模板DNA的要求不高,采用煮沸法提取基因組DNA,不僅節(jié)約提取時間,而且也大大降低檢測成本。
本研究分別檢測了54份Bb樣品和44份Pm樣品,同時與實驗室已建立的PCR方法做了比較,結(jié)果表明:Bb-LAMP方法的陽性檢出率為77.78%,特異性為85.71%,敏感性為100%,符合率為96.3%;Pm-LAMP方法的陽性檢出率為47.73%,特異性為88.46%,敏感性為100%,符合
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