蠟樣芽胞桿菌檢測

1、蠟樣芽胞桿菌檢測Examination of Bacillus cereus,,蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus),是芽胞桿菌屬（Bacillus）的一種，屬于土壤細(xì)菌 。在自然界廣泛分布于塵土、污水、河流和食品中，在蔬菜、谷類等農(nóng)作物和食品原料中主要以芽胞狀態(tài)存在。 已從多種食品中分離出該菌。涉及的食品有米、肉、乳制品、蔬菜、魚、糊、調(diào)味汁、布丁、湯、糕點、沙拉等。在食品混合物如醬油、布丁、湯、紅燒蔬菜燉肉中也發(fā)現(xiàn)該

2、菌。 1950年首次在挪威明確報告其致病作用。,蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒,蠟樣芽胞桿菌食物中毒以夏季（6 ～ 10月）最高。引起中毒的食品往往由于食前保存溫度不當(dāng)，放置時間較長或食品加熱不徹底而導(dǎo)致中毒。,蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒,該菌引起的食物中毒發(fā)病率較高有可能在可疑食品中找不到蠟樣芽胞桿菌一般認(rèn)為該菌為條件致病菌，中毒是產(chǎn)生腸毒素所致 進(jìn)食其中污染菌量>105／g的食物時，就可能發(fā)生食物中毒。,引起食物中毒的原

3、因－腸毒素,嘔吐毒素：一種環(huán)形，小分子量、熱穩(wěn)定多肽，100℃30min不能被破壞，為引起嘔吐型中毒的致病因素，常在米飯中形成。腹瀉毒素：一種大分子量蛋白，水樣腹瀉、腹部痙攣和疼痛，嘔吐很少見。能在各種食物中形成;,引起食物中毒的主要食物種類,美國 炒米飯歐洲 甜點、肉餅、色拉、奶和肉制品中國 米飯、淀粉類制品,在國內(nèi)，于1973年首次報告了南京某托兒所兒童因進(jìn)食泡飯引起嘔吐型蠟樣芽胞桿菌食物中毒后，至今除西藏外，每個省、自治區(qū)、

4、直轄市已經(jīng)都有報，有些地區(qū)甚至占細(xì)菌性食物中毒的首位。,臨床表現(xiàn),“嘔吐型”：潛伏期為0.5h～5h，是由于人攝入本菌在食品中產(chǎn)生的毒素引起的，原因食品主要為米飯類、面類（掛面、蕎麥面餅）等。癥狀以惡心、嘔吐為主，病程不超過24h?！案篂a型”：潛伏期為8h～16h，是由于本菌在腸道內(nèi)增殖過程中產(chǎn)生腸毒素引起的，原因食品主要為肉類、肉湯和其它食物。癥狀為水瀉、腹痛、腹痙攣為主，病程約24h。,芽胞桿菌屬,70個種，臨床上可以分離到的有一

5、下種類：,,蠟樣芽胞桿菌分類為芽胞桿菌屬的第I群。,蠟樣芽胞桿菌生物學(xué)特性,,在營養(yǎng)肉湯中32℃培養(yǎng)3d后，芽胞形成率在90％以上，80℃-85 ℃水浴5min-10min可刺激芽胞萌發(fā)。,新國標(biāo)編制說明,新國標(biāo)編制說明,為了在食品中有效開展蠟樣芽胞桿菌檢測，以保障食品安全，降低蠟樣芽胞桿菌感染的風(fēng)險， 防止食源性蠟樣芽胞桿菌疾病的發(fā)生，我國在1984年制定了《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》（GB/T 4789.14-1988

6、）標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的頒布為蠟樣芽胞桿菌的規(guī)范檢測，為蠟樣芽胞桿菌病的監(jiān)測、預(yù)防、控制起到了重要的作用。,背景,在以后的二十年時間里，食品中蠟樣芽胞桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過1994年、2003年二次修訂，但內(nèi)容可以說完全與1984年版相同。,現(xiàn)行GB/T 4789.14-2003標(biāo)準(zhǔn)不足處,1. 對蠟樣芽胞桿菌含量少于1000cfu/g的樣品計數(shù)效果差。2.采用的36℃±1℃培養(yǎng)溫度并非是蠟樣芽胞桿菌最適生長條件。3.檢驗結(jié)果與現(xiàn)行的其

7、它國家的標(biāo)準(zhǔn)存在一定差異。,提高檢出率,蠟樣芽胞桿菌的最佳生長溫度為30～32℃。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)修訂協(xié)作組驗證：30 ℃±1 ℃ 培養(yǎng)48h，平均生長率93.69%。30 ℃±1℃ 培養(yǎng)24 h，平均生長率92.28%。36 ℃±1 ℃ 培養(yǎng)24 h。平均生長率82.32%。,提高檢出率,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)溫度的生長率顯著高于36 ℃±1 ℃ (P﹤0.05），但在培養(yǎng)溫

8、度相同的情況下，培育時間24h和48h蠟樣芽胞桿菌生長率無顯著差異（P﹥0.05）。,表1 MYP培養(yǎng)條件選擇結(jié)果,擴大檢測范圍,在定量檢測方面，美國FDA、ISO、以及SN 0176-92標(biāo)準(zhǔn)除采用平板計數(shù)外，還采用了MPN法。新標(biāo)準(zhǔn)增加MPN法，以彌補樣品中蠟樣芽胞桿菌帶菌量少于103 cfu/mL時用平板計數(shù)法計數(shù)不準(zhǔn)的問題；該方法操作與現(xiàn)行大腸菌群的操作類似，容易推廣使用。,便于與國際接軌,隨著經(jīng)濟全球化的發(fā)展，食品貿(mào)易不斷

9、擴大，食品安全問題越來越到受各國政府的重視，為了保護(hù)我國消費者健康，避免貿(mào)易摩擦，急需對原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，使其與國際接軌。,提高方法的適用性和可操作性,新標(biāo)準(zhǔn)將考慮我國的實際情況，使蠟樣芽胞桿菌檢測方法具有更好的適用性和可操作性。并保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性。,新標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.14-2003相比主要修改如下:,---修改了標(biāo)準(zhǔn)的中英文名稱；---增加了第二法 蠟樣芽胞桿菌MPN 計數(shù)法；---將選擇性分離培養(yǎng)基（MYP）培養(yǎng)條件

10、由37 ℃培12 h-20 h改為30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h-48 h；---增加了根狀生長試驗和溶菌酶試驗。---增加了附錄A、附錄B。,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗（修訂版）,1 范圍,本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蠟樣芽胞桿菌的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較高的食品中蠟樣芽胞桿菌的計數(shù)；第二法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較低的食品樣品中蠟樣芽胞桿菌的計數(shù)。,2 設(shè)備和材料,除微生物實驗室

11、常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備和材料如下：冰箱：2 ℃-5 ℃;恒溫培養(yǎng)箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃;均質(zhì)器;電子天平：感量0.1 g ;無菌錐形瓶：100 mL、500 mL;無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭;無菌平皿：直徑90 mm;無菌試管：18 mm×180 mm;顯微鏡：10倍-100倍（油鏡）;L涂布棒。

12、,3 培養(yǎng)基和試劑,3.1 磷酸鹽緩沖液（PBS） 3.2 甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂 3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯 3.4 營養(yǎng)瓊脂 3.5過氧化氫溶液 3.6動力培養(yǎng)基 3.7硝酸鹽肉湯 3.8酪蛋白瓊脂,3 培養(yǎng)基和試劑,3.9 硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 3.10 糖發(fā)酵管 3.11 V-P培養(yǎng)基 3.12 胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂 3.13 溶菌酶營養(yǎng)肉湯 3.14 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基

13、3.15 明膠培養(yǎng)基,蠟樣芽胞桿菌平板計數(shù)法（第一法）,4 檢驗程序,5 操作步驟,5.1 樣品處理,冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15 min或在2℃～8℃不超過18 h解凍。若不能及時檢驗，應(yīng)放于-15℃左右保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時檢驗。若不能及時檢驗，應(yīng)置于2℃～8℃冰箱保存，在24 h內(nèi)檢驗。,5.2　樣品制備,以無菌操作取樣品25 g（mL），加入PBS 225 mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000 r/min～10

14、000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min。如無均質(zhì)器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后稱取25 g（mL）置合適的容器中，加225 mL PBS，充分振蕩混勻。制成1:10的樣品勻液。,5.3 樣品的稀釋,吸取上述1:10的樣品勻液1 mL加到裝有9 mL PBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次

15、，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。,5.4　樣品接種,根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～ 3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接種量分別入三塊MYP瓊脂平板，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25 ℃ ～ 50 ℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。,5.5　分離、培養(yǎng),5.5.1 分離在通常情況下，涂布后，將平板靜

16、置10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱30 ℃±1 ℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24 h±2 h再觀察。,分離,在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。,5.5.2 純培養(yǎng),從每個平板中至少挑取3個典型菌落（小于3個全選），分別劃

17、線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，進(jìn)行確證實驗。在營養(yǎng)瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展?fàn)?，直徑? mm ～ 10 mm。,營養(yǎng)瓊脂平板純化培養(yǎng),6　確證實驗,6.1　形態(tài)挑取純培養(yǎng)的單個菌落，作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性芽胞大桿菌，大小為（1～1.3）μm×（3～5）μm，芽胞呈橢圓形位于菌體中央

18、或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長鏈狀排列。,蠟樣芽胞桿菌－革蘭氏染色,蕈狀芽胞桿菌－革蘭氏染色,菌體，游離芽胞,巨大芽胞桿菌,6.2　生化鑒定,挑取純培養(yǎng)的單個菌落，進(jìn)行過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用(厭氧)試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗。蠟樣芽胞桿菌的主要生化特征見表1。,表1 蠟樣芽胞桿菌的主要生化特征,蠟樣芽胞桿菌生化特征,過

19、氧化氫酶＋；葡萄糖利用（厭氧）＋；硝酸鹽還原＋；V-P試驗＋；甘露醇產(chǎn)酸－；酪蛋白分解＋；,6.2.1 溶血試驗,挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。 蠟樣芽胞桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而多數(shù)炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。,蠟樣芽胞桿菌－完全溶血環(huán)（24h

20、）,蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈弱溶血現(xiàn)象，巨大芽胞桿菌不溶血。,6.2.2　根狀生長試驗,挑取單個可疑菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。蕈狀芽胞桿菌形成根狀生長的特征。多數(shù)蠟樣芽胞桿菌菌株形成粗糙的似毛玻璃狀或融蠟狀的菌落。,根狀生長,根狀生長,30℃，24h培養(yǎng)，室溫放置3天后根狀生長觀察。,6.2.3　蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗,取經(jīng)30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h

21、7;2 h并于室溫放置3 d～4 d的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿0.5％堿性復(fù)紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染液沸騰)持續(xù)1 min～2 min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。,觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形、正方形或其它形狀的蛋白結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽胞形成

22、的不豐富，應(yīng)將培養(yǎng)物置室溫2 d～3 d再行檢查。放置3d～4d以上的蘇云金芽胞桿菌培養(yǎng)物有大量的結(jié)晶體，但是只有在芽胞裂解通過上述染色方法才能見到。然而，除非見到芽胞，否則培養(yǎng)物應(yīng)在室溫繼續(xù)放置幾天以重新檢查毒素晶體。其它芽胞桿菌不產(chǎn)生蛋白質(zhì)毒素晶體。,蘇云金芽胞桿菌－蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶,游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形、正方形或其它形狀的蛋白結(jié)晶體。,蘇云金芽胞桿菌－蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶,蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶形態(tài)觀察,芽孢形成期的菱形晶體蛋白

23、掃描電鏡觀察（20kv，9.5mm＊15.0k）,光學(xué)顯微鏡觀察 100倍油鏡,6.2.4　溶菌酶耐性試驗,用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36℃（or30）±1 ℃培養(yǎng)24h。蠟樣芽胞桿菌在本培養(yǎng)基（含0.01％溶菌酶）中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24h。巨大芽胞桿菌不生長。,6.6　生化分型,可根據(jù)對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P試驗反應(yīng)、明膠液化試驗，將蠟樣芽胞桿菌分成不同生

24、化型別。,7 結(jié)果計算,7.1 典型菌落計數(shù)和確認(rèn)7.1.1 選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數(shù)合計在20 CFU～200 CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)。,如果：a）只有一個稀釋度的平板菌落數(shù)在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20 CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；c）某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于20

25、0 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；,d）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)大于200 CFU且有典型菌落，應(yīng)計數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落；e）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在20 CFU-200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200 CFU時，應(yīng)計數(shù)最接近20 CFU或200 CFU的稀釋度平板上的典型菌落。以上按公式（1）計算。,f）若2 個連續(xù)稀釋度的平板菌落

26、數(shù)均在20 CFU-200 CFU之間，按公式（2）計算。4.4.1.2從典型菌落中至少挑取5個典型菌落（小于5個全選），劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。4.4.2 計算公式4.4.2.1 公式（1）T=AB/Cd(1)式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B——鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C——用于蠟樣芽胞桿

27、菌鑒定的菌落數(shù)；d ——稀釋因子。,公式（2）,)式中：T ——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；C2——第二稀釋度（高稀

28、釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；1.1——計算系數(shù)（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結(jié)果為0，計算系數(shù)采用1）；d ——稀釋因子（第一稀釋度）。,8 結(jié)果報告,根據(jù)MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按公式計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數(shù)，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。,蠟樣芽胞桿菌MPN計數(shù)法（第二法）,10.1-10.3 樣品處理、樣品制備和樣品稀釋同平板計數(shù)法,10.4

29、 樣品接種,取三個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種于10 mL胰酪胨大豆多粘菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL（如果接種量需要超過1 mL，則用雙料胰酪胨大豆多粘菌素肉湯）。于30 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h±2 h。,10.5 培養(yǎng),用接種環(huán)從各管中分別移取1環(huán)，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。如果菌落不典型,可繼續(xù)培養(yǎng)24 h&

30、#177;2 h再觀察。,10.6　確證實驗,從每個平板選取至少5個典型或可疑菌落，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h，進(jìn)行確證實驗。,11　結(jié)果報告,MPN計數(shù)結(jié)果報告方式：根據(jù)證實為蠟樣芽胞桿菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌的MPN值。,注意事項,MPN法法可以彌補樣品中蠟樣芽胞桿菌帶菌量少于103 cfu/mL時用平板計數(shù)法計數(shù)不準(zhǔn)的問題，同