炭疽芽胞桿菌染色體特異序列篩選及其實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè).pdf

1、炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)是一種大型的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，是引起人類及動(dòng)物烈性傳染病——炭疽的病原體。在自然界中炭疽桿菌主要以芽孢形式的存在于土壤、動(dòng)物糞便和空氣中，由于炭疽芽胞桿菌致命的致病力和炭疽芽孢對(duì)自然環(huán)境強(qiáng)大的抵抗力，炭疽一直是世界上研究最多分布最廣的頭號(hào)生物戰(zhàn)劑。早期快速特異檢測(cè)空氣、土壤、水源以及可疑標(biāo)本中的炭疽芽孢桿菌可以有效降低感染人群的死亡率、阻斷病原的更大規(guī)模擴(kuò)散，是國(guó)家防生應(yīng)急體系的核心環(huán)節(jié)，

2、具有非常重大的意義。 檢測(cè)炭疽芽胞桿菌的方法主要有基于培養(yǎng)和生化鑒定的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法、基于抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)方法和基于基因組特異序列的核酸檢測(cè)方法。核酸檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，速度快，技術(shù)成熟，標(biāo)本中的炭疽芽胞桿菌在生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行核酸釋放處理階段通常被滅活，相對(duì)其它檢測(cè)方法更安全。基于TaqMan探針技術(shù)的實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定，引物、探針和模板序列之間的雙重特異性克服了傳統(tǒng)PCR的缺陷，是炭疽芽胞桿菌的快速

3、檢測(cè)比較理想的技術(shù)手段。 一種核酸檢測(cè)方法通常面臨的核心問(wèn)題是如何選擇針對(duì)檢測(cè)物種特異的核酸檢測(cè)靶點(diǎn)。不同于其它菌種，炭疽芽胞桿菌與自然界中廣泛分布的臘樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌等菌種同屬于臘樣芽胞桿菌群，這些近源菌種在核酸水平具有相當(dāng)高的同源性，傳統(tǒng)的菌種鑒定標(biāo)志如16sRNA序列、23sRNA序列、16/23sRNA間隔區(qū)序列在這些菌種之間僅具非常微小的差異，這決定了尋找炭疽芽胞桿菌染色體特異序列(genomi

4、csignatures)具有較大的挑戰(zhàn)性。早期的炭疽芽胞桿菌核酸檢測(cè)方法大都選擇炭疽芽胞桿菌攜帶的兩個(gè)毒性質(zhì)粒pX01和pX02作為特異檢測(cè)靶點(diǎn)，但是毒性質(zhì)粒并不穩(wěn)定，容易缺失，轉(zhuǎn)移和突變。大量研究已經(jīng)證明，盡管炭疽芽胞桿菌和其近源菌種具有很高的同源性，但是它們的基因組序列之間確實(shí)存在散在分布的差異序列。因此，在相對(duì)保守的染色體上尋找、選擇炭疽芽胞桿菌獨(dú)有的特異序列(genomicsignatures)作為檢測(cè)靶點(diǎn)，再利用高度敏感特異的

5、熒光定量PCR技術(shù)建立炭疽芽胞桿菌核酸檢測(cè)方法，既可以提高檢測(cè)的特異性，又可以克服以往僅依靠毒性質(zhì)粒pX01和pX02的檢測(cè)方法的局限性。因此，該方法近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于炭疽芽胞桿菌快速檢測(cè)，一些染色體特異檢測(cè)序列也見諸報(bào)道，但后續(xù)研究相繼證實(shí)這些序列的檢測(cè)靈敏度、特異性以及檢測(cè)速度不夠理想。為了尋找新的炭疽芽胞桿菌染色體特異檢測(cè)序列，本研究從117段炭疽芽胞桿菌染色體特異序列中篩選出6段最優(yōu)序列，設(shè)計(jì)TaqMan探針和引物，建立了一種快

6、速、準(zhǔn)確、特異定量檢測(cè)炭疽芽胞桿菌的新方法 一、炭疽芽胞桿菌染色體特異序列的篩選及驗(yàn)證。 對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的共117段炭疽芽胞桿菌染色體特異序列進(jìn)行兩次篩選。首先利用NCBIBLAST-tn比對(duì)所有候選序列，篩選出完全符合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中炭疽芽胞桿菌基因組數(shù)據(jù)的候選序列。序列入選條件：與GenBank中炭疽芽胞桿菌基因組具100％同源性(BLASTE-value=0)；與其它物種尤其是炭疽芽胞桿菌近源菌種不具有或僅具極低

7、同源性(BLASTE-value≥0.1)，符合條件的序列可認(rèn)為具有較理想的理論特異性。其次，為了得到適合TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法目標(biāo)序列，在滿足特異性的基礎(chǔ)上還必須根據(jù)TaqMan復(fù)合探針和引物的設(shè)計(jì)的原則，對(duì)這些序列進(jìn)行二次篩選。由于第一次篩選中得到的部分特異片段長(zhǎng)度較短(小于200bp)，難以同時(shí)找出理想的引物對(duì)和探針，根據(jù)GenBank中炭疽芽胞桿菌全基因組序列向其3’和5’端各延伸200bp得到600bp左右的加長(zhǎng)序

8、列(expandedsequence)，并再次利用第一步的篩選方法和入選條件驗(yàn)證這些加長(zhǎng)序列的特異性。最終共從117段候選序列中得到了11段具有100％同源性和8段具有99％以上同源性的炭疽芽胞桿菌基因組特異序列。根據(jù)TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)條件從11段100％特異序列中篩選出6段(C01-C06)既滿足炭疽芽胞桿菌特異性又符合TaqMan探針和引物設(shè)計(jì)原則的特異序列。利用Oligo6.0軟件人工設(shè)計(jì)6段特異序列及pagA基因、cap

9、B基因的TaqMan探針和引物，所有探針、引物及理論擴(kuò)增片段序列再經(jīng)BLAST-tn驗(yàn)證具100％特異性。 二、炭疽芽胞桿菌常規(guī)PCR、雙重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及模擬污染標(biāo)本的檢測(cè) 為了驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的特異性和靈敏性，并從6套基因組特異序列引物探針中選擇一套相對(duì)較好的方案用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，將所有8對(duì)引物(C01～C06片段、pagA、capB)分別對(duì)不同濃度、不同方法抽提的炭疽芽胞桿菌基因組DNA及其

10、它近源菌株基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，經(jīng)多輪反應(yīng)條件優(yōu)化后選定特異性較好，擴(kuò)增效果穩(wěn)定的C04片段用于定量PCR檢測(cè)方法；進(jìn)一步對(duì)基于C04片段與capB、pagA基因的雙重及多重PCR的反應(yīng)條件和檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和分析，建立了C04片段與capB基因的雙重PCR檢測(cè)體系。繼而利用C04片段與炭疽芽胞桿菌毒性質(zhì)粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本體系的檢測(cè)靈敏度達(dá)到每PCR反應(yīng)10～

11、100個(gè)拷貝，利用12種相關(guān)菌株評(píng)價(jià)后獲得100％特異性。在此基礎(chǔ)上利用10份炭疽芽胞桿菌污染的生活用水和土壤標(biāo)本以及20份對(duì)照標(biāo)本驗(yàn)證本體系的檢測(cè)能力，結(jié)果顯示所有污染標(biāo)本均被檢出，所有對(duì)照標(biāo)本均為陰性。 小結(jié)： 1.本實(shí)驗(yàn)篩選117段炭疽芽胞桿菌特異序列，經(jīng)雙重特異性驗(yàn)證后得到19段比較理想的炭疽芽胞桿菌特異序列，根據(jù)TaqMan探針引物設(shè)計(jì)原則選擇其中6段設(shè)計(jì)TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方案。 2.經(jīng)常規(guī)

12、PCR和雙重PCR實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選其中的C04片段建立了TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)體系。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本體系具有較理想的檢測(cè)靈敏度和特異性，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在4小時(shí)以內(nèi)完成，而基于C04、capB基因序列建立的雙重PCR檢測(cè)體系不僅可以用作一種基于普通PCR儀的檢測(cè)方法，更為進(jìn)一步研究炭疽芽胞桿菌多重實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)；此外，C04片段作為一種全新的特異序列用于炭疽芽胞桿菌實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。研究得到的19段