炭疽芽胞桿菌BslA蛋白粘附功能研究.pdf

1、炭疽病是由炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)引起的一種人畜共患烈性傳染病，主要通過皮膚、呼吸道和消化道感染動物和人，嚴(yán)重危害人類和家畜的生命健康。大量研究表明，單一的PA組分疫苗并不能夠提供完全的免疫保護(hù)，以PA為主，輔以其它來自菌體或芽胞的保護(hù)性組份是一個(gè)比較理想的炭疽疫苗研究策略，因此研究者一直致力于尋找和鑒定新的炭疽芽胞桿菌保護(hù)性抗原。
　　 炭疽芽孢桿菌的細(xì)胞外膜由一層二維晶狀結(jié)構(gòu)S層蛋白包裹，其生物學(xué)功

2、能主要是作為保護(hù)性的外膜、分子泵和細(xì)菌粘附等。BslA蛋白(B.anthracisS-layerproteinA)由炭疽芽胞桿菌pXO1致病島區(qū)域上的bslA(pXO1-90)基因編碼，包含652個(gè)氨基酸殘基。BslA蛋白N端1-259位氨基酸殘基中含有三個(gè)保守的SLH基序(S-layer-homologousmotifs)，是一種典型的S層蛋白。BslA蛋白炭疽芽胞桿菌感染宿主后有穩(wěn)定的表達(dá)，天然表達(dá)的BslA與其它S層蛋白共同展示于

3、菌體表面。研究表明BslA蛋白在炭疽芽胞桿菌致病過程中起著重要作用。本研究擬對BslA蛋白功能及其核心結(jié)構(gòu)域方面進(jìn)行研究，具體如下：
　　 第一部分工作利用PCR的技術(shù)擴(kuò)增bslA基因片段，進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建、重組蛋白分離純化、多克隆抗體制備，并且通過流式細(xì)胞、細(xì)菌粘附抑制實(shí)驗(yàn)、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)方法鑒定BslA蛋白的功能。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，成功構(gòu)建重組菌株pET28a-BslA/Rosetta((DE3)并對BslA實(shí)現(xiàn)了可溶性表

4、達(dá)。通過ProBondTMPurificationsystem得到純度在87％以上的BslA蛋白，流式細(xì)胞與免疫熒光的結(jié)果表明BslA蛋白具有黏附功能。細(xì)菌粘附抑制實(shí)驗(yàn)計(jì)算出BslA重組蛋白及其抗血清能夠抑制約為98％的炭疽桿菌黏附，表明BslA蛋白可能是一種潛在的保護(hù)性抗原。
　　 第二部分工作中，本實(shí)驗(yàn)通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件，確定核心功能結(jié)構(gòu)域可能存在的位置，從而進(jìn)行分段研究。為了更好、更方便的撿測，我們將蛋白片段與EGFP蛋

5、白融合表達(dá)，使EGFP成為標(biāo)簽。再通過免疫熒光等方法檢測BslA蛋白片段功能。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pET28a-EGFP/Rosetta(DE3)和實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)，并對其進(jìn)行了純化。表達(dá)分析和流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的EGFP蛋白有很好的熒光性。另外，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)軟件的預(yù)測我們對BslA蛋白進(jìn)行了首次分段，成功構(gòu)建了pET28a-EGFP-BslA(260-500)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(411

6、-560)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(511-652)/Rosetta(DE3)，進(jìn)行了截短BslA的表達(dá)與純化。經(jīng)熒光電鏡檢測結(jié)果表明，BslA(260-500)、BslA(411-560)具有黏附功能，以此推斷核心功能結(jié)構(gòu)域位于BslA蛋白的411-500位氨基酸。根據(jù)此結(jié)果，進(jìn)行了第二次分段，成功構(gòu)建pET28a-EGFP-BslA(411-455)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGF

7、P-BslA(431-485)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(456-500)/Rosetta(DE3)重組菌，對表達(dá)的蛋白進(jìn)行了純化。免疫熒光檢測的結(jié)果表明BslA(411-455)、BslA(431-485)片段具有粘附功能，進(jìn)一步確定了BslA蛋白的核心功能結(jié)構(gòu)域位于431-455位點(diǎn)。
　　 綜上，BslA是一種重要的保護(hù)性抗原，可能在新一代炭疽疫苗的研究和開發(fā)中扮演重要的角色。BslA蛋白