蘇云金芽胞桿菌新cry基因克隆、表達(dá)與殺蟲功能研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)害蟲的防治，一直以來都是我國農(nóng)業(yè)面臨的主要問題，大量施用化學(xué)農(nóng)藥是害蟲防治最主要的解決方案。但化學(xué)農(nóng)藥的濫用，已經(jīng)對(duì)人類健康和環(huán)境造成了巨大危害，同時(shí)引起了害蟲抗藥性產(chǎn)生的嚴(yán)重后果，使得田間用藥量進(jìn)一步增加，防治成本不斷加大，污染進(jìn)一步加重。生物防治是解決這些問題的有效途徑之一。在過去的60年中，因?qū)Νh(huán)境和人畜安全、無殘留，蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)，作為一種優(yōu)秀的生物殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)害蟲

2、防治中扮演了重要的角色，已經(jīng)發(fā)展成為全球產(chǎn)量最大、應(yīng)用面積最廣的微生物殺蟲劑。
　　 Bt是一種可以形成芽胞的革蘭氏陽性菌，其伴孢晶體蛋白對(duì)多種屬的昆蟲有毒殺作用。由于不同的Bt蛋白對(duì)不同的農(nóng)業(yè)害蟲有著不同的生物活性，其殺蟲譜專一,這就迫切要求發(fā)現(xiàn)新的基因和發(fā)掘已知基因的新的活性。
　　 首先利用PCR-RFLP鑒定Bt菌株S6，發(fā)現(xiàn)可能存在有cry1A、cry1E、cry1K、等基因型設(shè)計(jì)cry1Ah全長引物以菌株S6

3、質(zhì)粒為模板，克隆了cry1Ax基因全長，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。對(duì)Cry1Ax蛋白進(jìn)行了生物活性測定，測定對(duì)象為小菜蛾P(guān)lutella. Xylostella (Linnaeus)和亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)。均具有高毒力LC50分別為0.6990μg ml-1，5.0939μg g-1。對(duì)敏感棉鈴蟲有顯著的體重抑制作用LWC50為17.4908μg ml-1。
　　 利用兩種蘇云金芽胞

4、桿菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其組合，分別對(duì)Cry1Ac抗性種群小菜蛾幼蟲進(jìn)行生物活性測定。結(jié)果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8對(duì)兩種目標(biāo)試蟲均有高毒力，LC50分別為0.2175、0.6706μg /mL；Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。兩種蛋白混配的結(jié)果也表現(xiàn)出高毒力，LC50為0.4375μg/mL，沒有顯著的協(xié)同增效作用，也不存在拮抗。敏感與抗性小菜蛾種群生測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析比較，結(jié)果表明這兩種蛋白及其組合與C

5、ry1Ac并無交互抗性。
　　 對(duì)運(yùn)用PCR-RFLP無法鑒定的菌株SC7-D1，運(yùn)用PCR兩步法，克隆出一段基因片段，全長1414bp，翻譯成氨基酸的比對(duì)結(jié)果顯示，存在cry類基因的典型的三個(gè)結(jié)構(gòu)域，或其片段。并與Cry8Ka2相似性最高，為46％，可能是一個(gè)新的模式基因的片段。
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室多種的Bt蛋白對(duì)楊扇舟蛾和舞毒蛾兩種危害嚴(yán)重的林業(yè)害蟲進(jìn)行了初篩。舞毒蛾：Cry2Ab 0.39ppm死亡率16.7％，1