蘇云金芽胞桿菌酪氨酸酶基因的克隆、表達及應用初探.pdf

1、酪氨酸酶基因(mel)編碼的酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關鍵酶.該酶催化底物L-酪氨酸形成L-多巴,并經一系列氧化過程合成黑色素.黑色素具有多種重要的生理功能,特別是其抗紫外線,清除自由基的功能和應用價值倍受關注.由前人的研究結果已知蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)在酪素培養(yǎng)基42℃條件下產生可溶性棕黑色黑色素的基礎上,首先對該室保藏的近120余株蘇云金芽胞桿菌,其中包含約80個亞種和血清型,進行了產黑色素

2、的普查.結果表明,約50﹪測試菌株均在酪素培養(yǎng)基42℃高溫誘導下產生黑色素,產生黑色素的時間和濃度隨菌株不同而有所差別.在NCBI網站上比較已克隆的各種生物酪氨酸酶蛋白質氨基酸序列,得到其保守結構域的區(qū)段(編號pfam00264.8),將該區(qū)段氨基酸序列在部分已測序的蠟狀芽胞桿菌ATCC10987總基因組中進行tblastn分析,結果得到相似性最大的一段2.5kb的DNA序列.由于有人將蘇云金芽胞桿菌和蠟狀芽胞桿菌已報道的基因序列進行比

3、較發(fā)現(xiàn)二者的相似性高達98﹪,因此根據該2.5kb的DNA序列設計引物從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis 4D11)中擴增得到了包含酪氨基酸酶基因的1.2kb大小的DNA片段.通過引物引入的SacI和BamHI酶切位點將該片段亞克隆到載體pGEM-7zf上獲得重組質粒pBMB1179.將它轉入大腸桿工力DH5α,所得到的轉化子EMB1179在添加了0.1﹪L-酪氨酸的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16小時后能明顯合成

4、可溶性的黑色素.將如上條件下培養(yǎng)的EMB1179制備蛋白質樣品并進行SDS-PAGE電泳,結果得到與預期酪氨酸酶分子量大小一致的約28.5KD的特異蛋白質條帶.測定重組菌株EMB1179黑色素的產生隨時間變化曲線.結果表明,黑色素在菌體培養(yǎng)前6h內生成量不大,在6~18h內生成量逐漸增大,到18h達到峰值.與此同時,將EMB1179在酪素搖瓶37℃培養(yǎng)36h后在300nm紫外光下進行照射,根據菌體存活率的大小,斷定給該mel基因產生的黑

5、色素確定能在一定程度上保護菌體免受紫外輻射.利用PCR片段重疊延伸連接技術(SOE),將蘇云金芽胞桿菌酪氨酸酶基因的編碼區(qū)前端加和蘇云金芽胞桿菌芽胞非依賴型強啟動子pro3Aα,通過擴增引入的SphI和SacI酶切位點將此融合片段構建到穿梭載體pHT3101上獲得重組質粒pHTPM.將此重組質粒電轉化至蘇云金芽胞桿菌無晶體突變受體菌株BMB171,得到轉化子BMBPM.在30℃酪素培養(yǎng)基中,重組菌重組菌BMBPM已經能夠合成黑色素,但其