雅安周公山蘇云金芽胞桿菌基因資源研究和殺蟲(chóng)基因的克隆.pdf

1、本研究從四川雅安周公山原始森林土壤中采集土壤350份，應(yīng)用醋酸鈉-抗生素法篩選出132株蘇云金芽胞桿菌菌株，出菌率為11％。初步研究發(fā)現(xiàn)這些蘇云金芽胞桿菌的伴孢晶體類(lèi)型有菱形、方形、球形、無(wú)定形等，充分體現(xiàn)了我國(guó)菌株資源的多樣性。因此我們對(duì)雅安周公山蘇云金芽胞桿菌基因資源進(jìn)行了初步的研究和部分殺蟲(chóng)基因的克隆，主要結(jié)果如下： 1、通過(guò)對(duì)采集的350份土壤的海拔、資源、氣候等地理特征分析，總結(jié)出了Bt資源的分布規(guī)律：在海拔1742米

2、下，不同海拔高度的Bt出菌率經(jīng)差異顯著性分析后顯示其無(wú)明顯差異；腐質(zhì)土比黏土高、黏土又高于沙土；植被覆蓋率高的地區(qū)，生態(tài)條件優(yōu)越，Bt分離率高；土壤表面腐質(zhì)層越厚，土壤所含腐殖質(zhì)越豐富，Bt含量越多；山脈陽(yáng)坡出菌率比陰坡高。 2、對(duì)這132株Bt野生菌的伴孢晶體蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示殺鱗翅目、鞘翅目和雙翅目的殺蟲(chóng)蛋白帶最豐富，顯示了周公山Bt菌的殺蟲(chóng)蛋白具有一定的特異性。 3、對(duì)132株Bt野生菌的cr

3、y基因進(jìn)行了PCR-RFLP分析鑒定，發(fā)現(xiàn)含cry1型基因菌株有74株，cry2型為34株，cry7型16株，cry9型16株，cry3型13株，cry4型8株，cry30型7株，cry8型2株，cry4型2株，另外有46株菌含未知基因，占34.8％。結(jié)果顯示cry1基因含量最豐富，cry2基因其次，cry9和cry3基因第三。 4、克隆了cry9Ea4基因(Accessionnumber:EU760456)。該基因的核苷酸序列

4、為3468bp，與已報(bào)道的cry9Ea序列同源性高達(dá)99％。經(jīng)國(guó)際Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因命名委員會(huì)正式命名為cry9Ea4。 5、對(duì)132株Bt野生菌vip3基因進(jìn)行了PCR分析鑒定，發(fā)現(xiàn)有25株菌含Vip3A基因，出菌率為19％；另外有4株菌含新Vip3基因。 6、克隆了vip3A基因的部分序列。 7、對(duì)菌株ZG5-4、HY3-2進(jìn)行了菌種鑒定：ZG5-4定名為蘇云金芽胞桿菌臘螟變種(Bacillusthingi

5、ensisvargalleriae)；HY3-2菌株定名為蘇云金芽胞桿菌殺蟲(chóng)變種(Bacillusthringionsisvarentomocidus)。 8、對(duì)菌株ZG5-4和菌株HY3-2進(jìn)行了抗蟲(chóng)生物活性測(cè)定。結(jié)果表明菌株ZG5-4對(duì)鱗翅目的甜菜夜蛾、棉玲蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)有毒力，LC50分別為23.42ng/mL和13.24ng/mL，而菌株HY3-2對(duì)甜菜夜蛾、棉玲蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)的LC50分別為21.17ng/mL和14.07ng