蘇云金芽孢桿菌cry2Ad2基因的克隆與表達(dá).pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisBerliner，簡(jiǎn)稱Bt)是目前應(yīng)用最廣的一類微生物殺蟲劑，在過(guò)去的30多年中得到廣泛的研究和應(yīng)用。Bt的主要?dú)⑾x活性與其攜帶的編碼ICPs(InsecticidalCrystalProteins，ICPs)的cry基因密切相關(guān)，因此，cry基因工程研究便成為近幾年研究的熱點(diǎn)。自Schnepf和Whiteley(1981)分離克隆了第一個(gè)Btcry基因以來(lái)，到目前為止，國(guó)際上已

2、經(jīng)克隆了325種殺蟲蛋白基因，但是隨著Bt應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，BtICPs基因均在不同程度上引發(fā)了昆蟲的抗性，尋找新的高毒力菌株及基因是解決昆蟲抗性問(wèn)題的有效途徑之一。 本研究根據(jù)GenBank中cry2類基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)P1P2，擴(kuò)增得到cry2基因片斷，通過(guò)對(duì)此片斷的序列分析，設(shè)計(jì)了全長(zhǎng)引物對(duì)P3P4，以蘇云金芽孢桿菌新菌株S249質(zhì)粒DNA為模板，再次擴(kuò)增得到一大小約為2.0kb的全長(zhǎng)基因，并克隆到pGEM-TEasy載體上

3、，通過(guò)引物步行法測(cè)定該基因長(zhǎng)1919bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1902bp，編碼633個(gè)氨基酸，經(jīng)DNASTAR軟件分析，初步預(yù)測(cè)其蛋白分子量為70.72ku，等電點(diǎn)pI=8.26。序列比較結(jié)果表明，該基因與cry2Ad類基因高度同源(同源性達(dá)99％)只有2個(gè)核苷酸差異和1個(gè)氨基酸差異，已在GenBank中登錄，登錄號(hào)為DQ219823，并被Btδ-內(nèi)毒素基因國(guó)際命名委員會(huì)正式命名為cry2Ad2。 將cry2Ad2基因克

4、隆到表達(dá)載體pET28a(+)上，得到重組質(zhì)粒pE2d，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，利用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株BL21(pE2d)能正確表達(dá)Cry2Ad2蛋白，其分子量約為70ku左右。對(duì)表達(dá)的Cry2Ad2蛋白進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果表明，Cry2Ad2蛋白對(duì)四齡淡色庫(kù)蚊(Culexpipiens)和三齡小菜蛾(Plutellaxylostella)72小時(shí)的的LC50分別為205.3469μ