環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌研究.pdf

1、蠟樣芽孢桿菌是引起食物中毒的常見致病菌之一，食物暴露2h以上極易受污染，引起食物中毒的食品多為乳制品，米飯等蛋白質(zhì)含量多的食品。目前，國內(nèi)檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌仍采用傳統(tǒng)的方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長，通常需要3～5d。本研究建立了一套用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)方法的靈敏性。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是日本的NOTOMI發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，因?yàn)槠洳僮骱唵?、快速、特異性高、成?/p>

2、低等優(yōu)點(diǎn)，成為可以替代PCR的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。蠟樣芽孢桿菌在環(huán)境中廣泛存在，極易污染食品及食品原料，并且耐高溫不易被殺死，可以產(chǎn)生導(dǎo)致嘔吐和腹瀉兩種類型的食物中毒。因此，建立LAMP快速檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法對(duì)于控制蠟樣芽孢桿菌的食物中毒具有重要意義。 本研究針對(duì)蠟樣芽孢桿菌的特異基因hblA設(shè)計(jì)引物，用LAMP引物在線設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)內(nèi)引物濃度、外引物濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、BST酶濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，

3、建立LAMP反應(yīng)體系。 LAMP反應(yīng)體系如下:F3與B3(LAMP反應(yīng)外引物)各5pmol/μL；BIP與FIP(LAMP反應(yīng)內(nèi)引物)40pmol/μL；其它反應(yīng)組分終濃度分別為:1.0mmol/L dNTP，1.0mmol/L Betaine，6.0mmol/L MgSO4，2.5μL Bst酶緩沖液(20mM Tris-HCl(pH8.8，25℃)，10mM KCI，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％.

4、Triton X-100)，lμL(8U Bst大分子聚合酶，lμL目標(biāo)DNA，純水補(bǔ)足體積到25μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為62℃保存1h，80℃ 2min使酶滅活。 FTA卡是用螫合劑和變性劑浸泡過的纖維基質(zhì)，他可以在接觸微生物時(shí)將其吸附并裂解細(xì)胞，使DNA吸附在纖維基質(zhì)上。FTA可以高效、快速、低損耗的提取DNA。本研究將FTA與LAMP方法相結(jié)合，檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌。 對(duì)LAMP快速檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)，測(cè)定了

5、其檢出限，特異性，敏感性，符合率，并與PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比。嘗試了在反應(yīng)產(chǎn)物中加入EB，在紫外燈下快速觀測(cè)反應(yīng)結(jié)果的試驗(yàn)。結(jié)果表明:LAMP對(duì)抽提的DNA最低檢出濃度為4.4cfu/mL，PCR對(duì)DNA最低檢出濃度44cfu/mL。LAMP對(duì)消毒乳中蠟樣芽孢桿菌的活菌濃度最低檢出量為5.7cfu/mL，而PCR的檢出限為57cfu/mL。LAMP技術(shù)的靈敏度是PCR的10倍，并且比PCR方便快捷。LAMP擴(kuò)增最短可在20min內(nèi)完成