葡萄糖氧化酶的表達及其在半纖維素酶解方面的應用.pdf

1、木糖是一種單糖，它可以由半纖維素酶解得到。由于木糖不會導致糖尿病和肥胖等疾病的發(fā)生，它常常被用于作為蔗糖的替代品。過氧化氫(H2O2)預處理蔗渣可以促進分餾、溶解、水解和分離纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。而β-D-葡萄糖氧化酶（GOD）可以催化葡萄糖的氧化和氧氣的還原并生成過氧化氫。因此，GOD也許能夠取代H2O2的作用達到提高半纖維素水解效率的目的。為了驗證這一推測，我們設計一系列的實驗并對結(jié)果進行分析。
　　本研究中，為了提高GO

2、D的表達量以及為后續(xù)的深入研究打下一定基礎，我們構建并獲得了兩個單基因重組表達酵母。首先，黑曲霉CICC40179的GOD基因被克隆進載體pMD19-T。用BLAST進行序列分析表明這是一段新的未被報道過的GOD基因。3D結(jié)構模擬（DS2.5，Accelrys Software Inc.，San Diego，CA）比較了這個新的GOD蛋白和另一同源蛋白（Protein Data Bank登錄號：No.1CF3_A），結(jié)果顯示兩個突變的氨

3、基酸殘基位于蛋白質(zhì)結(jié)構的外側(cè)部分，突變并沒有改變其蛋白質(zhì)的整體結(jié)構。將這段基因序列分別通過載體 p2μRCMB和pGAPZαA導入釀酒酵母AS2.489和畢赤酵母X33中進行表達。重組釀酒酵母表達的GOD蛋白分子量約為100 kDa，而重組畢赤酵母的GOD蛋白分子量則約為70 kDa，且重組畢赤酵母的GOD酶活顯著高于重組釀酒酵母。選用重組畢赤酵母進行后續(xù)酶學特性、酶法水解等研究。GOD的最適 pH和溫度分別為7.5和35℃，在25℃、

4、30℃、35℃和40℃各培養(yǎng)2 h，酶活力幾乎沒有發(fā)生改變。因此，這個新的GOD可能是一種中溫酶并且具有較為寬廣的工作溫度。金屬離子Mn2+和Co2+能顯著提高GOD的活性，然而Zn2+則顯著的抑制酶活。對該重組畢赤酵母進行培養(yǎng)基成分正交優(yōu)化，使得GOD的活性從4.9 U/mL（搖瓶酶活）提升至16.31 U/mL（SL-05發(fā)酵罐酶活）。
　　由于GOD的催化特性，本研究嘗試將其應用于半纖維素酶解生產(chǎn)木糖的工藝過程。通過使用Bo