絲狀真菌纖維素酶農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建及其在纖維素酶學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、隨著不可再生的化石能源的不斷消耗，現(xiàn)有的以石油和煤炭為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)能源將會逐漸枯竭。世界各國家為了保障自身能源供應(yīng)，確保本國經(jīng)濟(jì)健康發(fā)展，先后著手尋找替代能源尤其是可再生性能源。纖維素是地球上最豐富的可再生性資源，占地球總生物量的40﹪，如果能將這種產(chǎn)量巨大的可再生性資源轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物和化工原料，對于人類社會的可持續(xù)性發(fā)展具有非常重要的意義?，F(xiàn)在纖維素降解的方法有很多，常用的酸或高溫處理的方法雖然也能降解纖維素，但同時(shí)會產(chǎn)生很

2、多難以接受的副產(chǎn)物，污染環(huán)境，并使葡萄糖受到破壞。于是人們把目光逐漸轉(zhuǎn)移到纖維素的酶解，但目前纖維素酶對纖維素的降解效率太低，成為大規(guī)模推廣使用的制約因素。為了解決這個(gè)問題，基因工程和蛋白質(zhì)工程手段被應(yīng)用到纖維素酶改造上來。以便解決目前困擾纖維素生物降解的關(guān)鍵問題：即研究清楚纖維素酶降解機(jī)制。 隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程手段被應(yīng)用到纖維素酶改造上來，另一個(gè)問題也隨之凸現(xiàn)出來，即目前還沒有找到適合纖維素酶的表達(dá)系。所以構(gòu)建合適的纖維

3、素酶表達(dá)系統(tǒng)也隨之成為束縛纖維素酶研究的瓶頸。目前研究資料表明，纖維素酶在大腸肝菌表達(dá)系中易形成包涵體、表達(dá)的酶活性比較低以及缺乏糖基化修飾等，這些問題使得大腸桿菌不能成為絲狀真菌纖維素酶的理想表達(dá)系。而在酵母中表達(dá)又由于存在著過度的糖基化和蛋白折疊問題，使表達(dá)的纖維素酶活性喪失嚴(yán)重，基本失去研究和應(yīng)用價(jià)值。絲狀真菌瑞氏木霉是在纖維素酶學(xué)研究和纖維素酶應(yīng)用中最為廣泛采用的纖維素酶高產(chǎn)菌，但是傳統(tǒng)的以潮霉素為代表的絲狀真菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法

4、由于轉(zhuǎn)化效率太低，加之絲狀真菌表達(dá)的為混合酶系，分離純化目的蛋白比較困難。這些缺點(diǎn)都直接限制了絲狀真菌作為纖維素酶表達(dá)宿主。 基于上述存在的問題，本文嘗試從構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化絲狀真菌入手，著手構(gòu)建起一套適合于纖維素酶學(xué)研究的絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)。 在成功構(gòu)建該絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，開展了兩個(gè)方面的工作。一是構(gòu)建了瑞氏木霉外切纖維素酶Ⅰ(CBHⅠ)在粗糙脈孢菌組成型表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在含有葡萄糖的培養(yǎng)條件下，可以抑制宿

5、主本身纖維素酶的分泌，僅表達(dá)外源目的外切纖維素酶 CBHI。這一工作為今后開展單一纖維素酶學(xué)研究和為今后構(gòu)建高酶活的纖維素酶生產(chǎn)菌建立了技術(shù)基礎(chǔ)。二是利用這一系統(tǒng)，和美國愛荷華州州立大學(xué)Chandrika Mulakala博士合作開展了纖維素酶CBH I的吸附結(jié)構(gòu)域和纖維素相互作用模式的研究。在美國愛荷華州州立大學(xué)Chandrika Mulakala博士的幫助下利用Swiss-pdb vkewer,PyMol等生物信息軟件分析了CBH

6、I的纖維素吸附結(jié)構(gòu)域并在其幫助下分析了她提出的纖維素酶CBH I在生物降解過程中的作用模式。經(jīng)過分析得到了幾個(gè)潛在的影響吸附結(jié)構(gòu)域跟纖維素結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)。借助于體外點(diǎn)突變技術(shù)對相應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變。并將這些點(diǎn)突變的基因構(gòu)建到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中。利用已經(jīng)建立的起來的轉(zhuǎn)化方法將其中兩個(gè)點(diǎn)突變了的基因轉(zhuǎn)化到了粗糙脈孢菌中，并得到了組成型的表達(dá)。經(jīng)過初步的酶學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還不能很好的支持Mulakala 博士提出的吸附結(jié)構(gòu)域糙面剝離假說，但