產(chǎn)黃青霉A4葡萄糖氧化酶及其基因克隆表達(dá)的研究.pdf

1、葡萄糖氧化酶在分子氧存在下催化葡萄糖氧化成過氧化氫和葡萄糖酸，反應(yīng)快速，專一性高，安全無毒，因此被廣泛應(yīng)用于食品加工和保鮮、發(fā)酵工業(yè)、紡織工業(yè)、醫(yī)學(xué)診斷和生物傳感器等行業(yè)。葡萄糖氧化酶主要來源于黑曲霉和青霉屬。目前主要以前者為葡萄糖氧化酶的工業(yè)產(chǎn)生菌，而對于后者來源的酶研究較少，后者相對前者具有底物親和力更高，易于分離，酶活穩(wěn)定性高的優(yōu)勢，可以降低工業(yè)生產(chǎn)過程中分離純化的成本，提高其定量檢測的靈敏度和應(yīng)用效果。
　　本研究從土壤和

2、發(fā)霉腐爛的水果樣品中分離純化得到了一株葡萄糖氧化酶產(chǎn)量較高的菌株，通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用基因工程技術(shù)將該酶基因在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，分別對天然酶和重組酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究，為開發(fā)一種新型的酶制劑提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.胞外葡萄糖氧化酶產(chǎn)生菌的篩選和鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究。采用Fiedure K.J平板顯色法從江蘇省420份不同來源的土壤和發(fā)霉腐爛的水果樣品中篩選得到34

3、株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的真菌。通過測定發(fā)酵上清液酶活，選定產(chǎn)酶活力最高編號為A4的菌株作為出發(fā)菌株。綜合18S、ITS、BenA、CO1多重序列同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建以及形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果，鑒定菌株A4為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）。
　　采用75％的硫酸銨飽和沉淀和50 kDa的超濾膜過濾，獲得電泳純的葡萄糖氧化酶，比活力為303 U/mg，回收率為30％，純化2.2倍。通過SDS-PAGE電泳和凝膠柱

4、層析色譜法確定該酶為同型二聚體，其亞基和全酶分子量分別為75kDa、149 kDa。該天然酶對D-甘露糖、D-果糖、L-阿拉伯糖等單糖均無催化活性，對D-半乳糖的催化速率僅為對β-D-葡萄糖的1％，表明該天然酶對β-D葡萄糖的底物專一性較好。該天然酶最適反應(yīng)溫度為35℃，最適反應(yīng)pH為5.0。酶的熱穩(wěn)定性較好，在50℃保溫1h，酶活仍保持約80％。Fe2+，F(xiàn)e3+，Cu2+，Mn2+對該酶有強(qiáng)烈的抑制作用;吐溫20，SDS和Ca2+對

5、該酶有促進(jìn)作用。該天然酶對β-D-葡萄糖的Km為1.3 mM，親和力較高，Vmax為7.5 U/mg。
　　2.對P.chrysogenum A4產(chǎn)胞外葡萄糖氧化酶的液體搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。采用單因素試驗和L9(33)正交試驗對該菌株的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基組合為碳源（葡萄糖）10％、有機(jī)氮源（麥芽浸粉）0.5％、無機(jī)氮源(NaNO3)1.7％。通過單因素試驗確定A4的培養(yǎng)條件為接種量1 mL、裝液量50 mL、

6、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間6d。在此條件下，酶活力提高到17.2 U/mL，為初始發(fā)酵條件下酶活的17.2倍。
　　3.P.chrysogenum A4葡萄糖氧化酶基因在巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的克隆表達(dá)。以P.chrysogenum A4基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增和測序得到1815bp的葡萄糖氧化酶基因序列。該基因編碼604個氨基酸，預(yù)測蛋白的理論分子量為66.3 kDa。與GeneBank上的序列進(jìn)行Blast比對后，僅與兩株

7、菌的葡萄糖氧化酶基因具有同源性，分別為P.chryso genum JN809249.1和土曲霉(Aspergillus terreus XP001215424)，同源性分別達(dá)到99％和75％。與前者編碼的氨基酸只有1處差異，為第58位的A（丙氨酸），與后者編碼的氨基酸相似度為76.2％。P.chrysogenum A4的葡萄糖氧化酶經(jīng)預(yù)測含有由18個氨基酸殘基組成的信號肽，4個潛在的N-糖基化位點(diǎn)(N111，N278，N374，N40

8、9)和3個處于保守位點(diǎn)的半胱氨酸殘基(C186，C228，C542)。將P.chrysogenumA4葡萄糖氧化酶基因與表達(dá)載體pPICZαA連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體GODP-pPICZαA后轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168，通過對發(fā)酵上清液的酶活進(jìn)行測定得到一株成功重組表達(dá)的酵母菌株R2。對重組酵母R2搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗確定最適的發(fā)酵條件為:BMMY培養(yǎng)基pH6.0，甲醇濃度2％，培養(yǎng)時間5d。采用80％的硫酸銨飽和沉淀和3

9、0 kDa的超濾膜過濾，獲得電泳純的葡萄糖氧化酶，比活力為150.1U/mg，活性回收率為48％，純化1.9倍。通過SDS-PAGE電泳確定該重組酶亞基的相對分子質(zhì)量為75 kDa。與天然酶比較，該重組酶對D-甘露糖具有催化活性，為催化D-葡萄糖活性的4％，表明重組酶對β-D葡萄糖的催化專一性仍較好。該重組酶最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為6.0。重組酶的熱穩(wěn)定性較天然酶有所提高，在50℃保溫1h酶活無下降，而在60℃保溫1h，酶活