BMP9和13對(duì)C3H10T1-2細(xì)胞心肌樣分化及改善心梗后大鼠心功能的影響.pdf

1、第一部分重組腺病毒BMP9，BMP13的擴(kuò)增及分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞
　　目的:利用重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP的病毒原液分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞從而反復(fù)擴(kuò)增獲得高滴度的重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP，利用AdEasy-BMP9，AdEasy-BMP13，AdEasy-BMPGFP轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞使其分別過(guò)表達(dá)BMP9和BMP13基因。并以新生C3H小鼠的原代心肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照，未處理的C

2、3H10T1/2細(xì)胞作為空白組。
　　方法:利用HEK293細(xì)胞反復(fù)擴(kuò)增獲得高滴度的重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP。以C3H新生小鼠(1-3d)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照。復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)的C3H10T1/2細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)觀察到視野中的細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70％左右時(shí)，將AdEasy-BMP9，AdEasy-BMP13，AdEasy-GFP加入培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，利用熒光顯微鏡下估算和流式細(xì)胞技術(shù)

3、直接檢測(cè)兩種方法明確各腺病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組細(xì)胞中BMP9，BMP13的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)過(guò)HEK293細(xì)胞反復(fù)擴(kuò)增，獲得了后續(xù)試驗(yàn)用于轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞的高滴度重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP。
　　2.利用C3H新生小鼠(1-3d)心肌細(xì)胞分離純化進(jìn)行原代培養(yǎng)，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形或多邊形，并有自主搏動(dòng)。作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照。
　　3.利用熒光顯

4、微鏡下估算和流式細(xì)胞技術(shù)直接檢測(cè)兩種方法明確三種腺病毒分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后的轉(zhuǎn)染效率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定BMP9組細(xì)胞（重組腺病毒BMP9轉(zhuǎn)染后的C3H10T1/2細(xì)胞）的BMP9表達(dá)量為GFP組和空白組的120-125倍，BMP13組細(xì)胞（重組腺病毒BMP13轉(zhuǎn)染后的C3H10T1/2細(xì)胞）的BMP13表達(dá)量為GFP組和空白對(duì)照組的125-130倍。(p＜0.05)
　　結(jié)論:利用HEK293反復(fù)擴(kuò)增得到的高滴度

5、重組腺病毒BMP9，BMP13和GFP，分別轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞后能夠使其獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，并分別高表達(dá)BMP9、BMP13以及GFP。
　　第二部分 BMP9及BMP13在體外對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞心肌樣分化的影響及其差異
　　目的:研究并比較BMP9(骨形成蛋白9，Bone morphogeneticprotein，9，)及BMP13（骨形成蛋白13，Bone morphogenetic protein13）在

6、體外對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分組如下:空白組（未處理的C3H10T1/2細(xì)胞），GFP組的（AdEasy-GFP轉(zhuǎn)染的C3H10T1/2細(xì)胞），BMP9組(AdEasy-BMP9轉(zhuǎn)染的C3H10T1/2細(xì)胞)，BMP13組（AdEasy-BMP13轉(zhuǎn)染的C3H10T1/2細(xì)胞），心肌細(xì)胞組（新生C3H小鼠的原代心肌細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)選取1周，2周，3周，4周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢

7、測(cè)各組細(xì)胞心肌特異性基因MEF2C，GATA4及離子通道相關(guān)編碼基因KCNA5，KCNJ12，CACNA1H，SCN5A的表達(dá)情況及差異;利用免疫熒光(Western-blot)和免疫印跡(Immunofluorescence)技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞肌鈣蛋白T(cTnT)、縫隙連接蛋白(Cx43)的是否有表達(dá)及其表達(dá)的差異;利用透射電鏡和馬松三色染色觀察各組細(xì)胞是否存在類(lèi)似心肌特異性超微結(jié)構(gòu)的表達(dá);利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞膜上是否存在

8、分別由鈣通道介導(dǎo)的鈣電流，、鈉通道介導(dǎo)的鈉電流及鉀通道介導(dǎo)的內(nèi)、外向鉀電流表達(dá)，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定介導(dǎo)各種電流的離子通道編碼基因的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)隨機(jī)分組后培養(yǎng)的各組細(xì)胞于倒置相差顯微鏡下觀察，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)BMP9，BMP13誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞更多呈長(zhǎng)梭形，連接更為緊密，排列更為有序一致。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative

9、pcr)檢測(cè)各組細(xì)胞心肌特異性基因MEF2C及GATA4的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明于誘導(dǎo)分化后1周開(kāi)始，就可以檢測(cè)到BMP9組和BMP13組心肌特異性基因MEF2C，GATA4的表達(dá)，分別為GFP組和空白組的3倍和2.5-3.5倍(p＜0.05)。 BMP9組和BMP13組離子通道相關(guān)編碼基因KCNA5，KCNJ12，CACNA1H的表達(dá)，分別為GFP組和空白對(duì)照組的3-3.5倍，1.5-4倍和2-6倍(p＜0.05); BMP9組中的S

10、CN5A為BMP913組，GFP組和空白組的4.5倍。(p＜0.05)
　　3.免疫熒光和免疫印跡技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞肌鈣蛋白T(cTnT)、縫隙連接蛋白(Cx43)的表達(dá)及其差異。經(jīng)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中，GFP組和空白對(duì)照組無(wú)cTnT、Cx43表達(dá)，BMP9組，BMP13組和心肌細(xì)胞組的cTnT和Cx43表達(dá)量明顯高于GFP組和空白組，且BMP9組表達(dá)高于BMP13組(p＜0.05)。同樣免疫熒光技術(shù)能夠在檢測(cè)BMP9組，BM

11、P13組和心肌細(xì)胞組檢測(cè)到cTnT和Cx43表達(dá)，GFP組和空白組無(wú)表達(dá)。
　　4.透射電鏡觀察心肌特異性超微結(jié)構(gòu)肌絲和閏盤(pán)的表達(dá)情況，和馬松三色染色觀察心肌特異性超微結(jié)構(gòu)肌絲。利用透射電鏡可以到觀察與心肌細(xì)胞組一樣，BMP9組及BMP13組有肌絲及閏盤(pán)樣的結(jié)構(gòu)，而GFP組和空白組無(wú)類(lèi)似結(jié)構(gòu);馬松三色染色可以觀察到BMP9組，BMP13組有紅染的肌絲樣結(jié)構(gòu)，而GFP組和空白組無(wú)類(lèi)似結(jié)構(gòu)。
　　5.單細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)各組細(xì)胞膜上

12、的鈣通道介導(dǎo)的鈣電流、鈉通道介導(dǎo)的鈉電流及鉀通道介導(dǎo)的內(nèi)、外向鉀電流表達(dá)。利用單細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)1、2、3、4周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞膜電流的表達(dá)情況。在誘導(dǎo)分化后4周，可以在BMP9組，BMP13組檢測(cè)到T型鈣電流(IT-Ca)，超速激活延遲整流鉀電流(Ikur)，內(nèi)向整流鉀電流(Ikir);僅在BMP9組少量細(xì)胞中可以檢測(cè)鈉電流(Ina)。上述電流均可在心肌細(xì)胞組中檢測(cè)到，而GFP組和空白對(duì)照組均未能檢測(cè)到上述電流。
　　6.實(shí)時(shí)熒

13、光定量PCR測(cè)定各種電流對(duì)應(yīng)離子通道編碼基因的表達(dá)差異。BMP9和BMP13組中，KCNA5的表達(dá)量是對(duì)照組的3-3.5倍(p＜0.05)，KCNJ12的表達(dá)量是對(duì)照組的1.5-4倍(p＜0.05)，CACNA1H的表達(dá)量是對(duì)照組的2-6倍(p＜0.05)，而B(niǎo)MP9組中SCN5A的表達(dá)量是對(duì)照組和BMP13組的4.5倍(p＜0.05)。
　　結(jié)論:BMP9和BMP13可以在體外培養(yǎng)的環(huán)境下促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的

14、分化，且BMP9的促分化作用優(yōu)于BMP13。
　　第三部分 BMP9及BMP13轉(zhuǎn)染后C3H10T1/2細(xì)胞對(duì)心梗后大鼠心功能的影響及其差異
　　目的:研究并比較BMP9和BMP13對(duì)C3H10T1/2細(xì)胞在體內(nèi)(SD大鼠心梗模型)向心肌樣細(xì)胞分化及對(duì)心梗后SD大鼠的心功能的影響。
　　方法:24只SD大鼠（全部選用雄性大鼠）隨機(jī)分為四組:MI組（單純心梗組，myocardial infarction，n=6只），MI

15、+GFP組(MI+pAdEasy-GFP轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞注射組，n=6只)，MI+BMP9組（MI+pAdEasy-BMP9轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞注射組，n=6只），MI+BMP13組(MI+pAdEasy-BMP13轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞注射組，n=6只)。利用心臟彩色多普勒超聲監(jiān)測(cè)術(shù)前及術(shù)后4周LVEDD（左室舒張末期內(nèi)徑），LVESD（左室收縮末期內(nèi)徑），F(xiàn)S（左室短軸縮短率）以評(píng)估并比較各組大鼠的心功能;利用熒

16、光顯微鏡觀察各組大鼠心臟冰凍切片，尋找手術(shù)時(shí)植入的帶有GFP綠色熒光示蹤的各組植入細(xì)胞;利用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察細(xì)胞植入部位的組織細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn);馬松三色染色觀察并比較各組心梗面積;免疫熒光觀察植入部位細(xì)胞心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T(cTnT)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.心臟彩色多普勒超聲提示術(shù)后4周，各細(xì)胞植入組心功能均有改善，MI+BMP9組，MI+BMP13組改善程度高于MI+GFP組，MI組，而MI+BMP

17、9組高于MI+BMP13組(P＜0.05)。
　　2.熒光顯微鏡下觀察各細(xì)胞植入組心臟冰凍切片，可見(jiàn)自帶GFP綠色熒光示蹤的植入細(xì)胞，多數(shù)沿血管分布。
　　3.HE染色可見(jiàn)MI+BMP9組，MI+BMP13，組植入細(xì)胞大量聚集，排列較為整齊。
　　4.馬松三色染色提示三個(gè)細(xì)胞植入組的心臟切片心梗面積百分比均小于MI組(P＜0.05)。但三個(gè)細(xì)胞植入組的心梗面積百分比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　5.免疫熒光