羅倫隱球酵母rho1基因的克隆及其在釀酒酵母中的轉化和表達.pdf

1、細胞壁完整性(Cell wall integrity，CWI)信號通路是真菌中普遍存在一條保守通路，在生長、繁殖、對逆境脅迫的感受和調(diào)節(jié)中均具有重要作用。Rho1蛋白作為CWI通路的主要調(diào)節(jié)因子能夠與膜傳感器信號整合后激活下游MAPK信號通路，參與細胞壁合成等多種生理調(diào)控。羅倫隱球酵母是目前廣泛報道的一種用于果實采后病害的生防酵母，但因其遺傳背景尚不明確，導致其在基因水平上研究進展緩慢。本課題通過轉錄組技術獲得羅倫隱球酵母的rho1基因

2、序列，在序列分析的基礎上通過釀酒酵母表達系統(tǒng)異源表達羅倫隱球酵母rho1基因，探究rho1基因轉化在提高重組酵母抗逆性和生防效力方面的可行性，研究結果對于明確rho1在生防酵母逆境適應和抑制果實病害中的作用等具有重要意義。主要研究結果如下：
　　羅倫隱球酵母rho1基因序列和所編碼的蛋白結構分析。通過對羅倫隱球酵母轉錄組高通量測序分析獲得rho1基因的cDNA序列為597 bp，運用PCR擴增得到rho1基因全長966 bp，包含

3、7個外顯子和6個內(nèi)含子，在基因結構上與新型隱球酵母及其相似;對羅倫隱球酵母Rho1蛋白結構預測結果顯示:Rho1蛋白由199個氨基酸組成，存在典型小GTP結合蛋白保守結構域，并有6個α-螺旋結構、6個β-折疊和5個Loop結構，與已知的Rho家族蛋白空間結構相似，因此推斷羅倫隱球酵母Rho1蛋白與已知Rho家族蛋白可能具有相似的生物學功能。
　　羅倫隱球酵母rho1基因克隆及在釀酒酵母中表達。用特異性引物擴增得到rho1基因cDN

4、A全長序列，利用Clonexpress高效的DNA定向克隆技術將rho1基因連接到載體上，并將重組載體通過電轉化導入釀酒酵母感受態(tài)細胞，在含有150μg/ml的殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基篩選得到轉化子，測序鑒定后構建重組釀酒酵母SC-rho1。
　　重組釀酒酵母SC-rho1抗逆性和生防效力評價。重組釀酒酵母對溫度和滲透壓的耐受性明顯高于野生型釀酒酵母，同時在37℃和滲透壓脅迫下重組釀酒酵母能更加有效抑制梨果實病害，與野生型釀酒酵母相比分