鼠疫caf1基因的克隆及其在酵母中表達(dá)的研究.pdf

1、本研究的目的是通過分子克隆技術(shù),構(gòu)建可表達(dá)caf1蛋白的酵母真核表達(dá)系統(tǒng).caf1基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建.首先設(shè)計(jì)合適的引物,通過PCR方法從1351/482 EV鼠疫質(zhì)粒上擴(kuò)增出caf操縱子片段.測序確定與文獻(xiàn)報(bào)道的操縱子序列完全一致,根據(jù)caf1目的基因在caf操縱子上所在的位置及相應(yīng)的載體特異性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物,通過PCR方法擴(kuò)增出含雙酶切位點(diǎn)的caf1目的基因.通過定向克隆方法將caf1目的基因連接到pESC-URA質(zhì)

2、粒上,并成功轉(zhuǎn)入E.coliDH5 α,獲得含caf1目的基因的表達(dá)載體pESC-URA-caf1.表達(dá)載體pESC-URA-caf1電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入釀酒酵母INVSc1中并成功表達(dá).將測序確定正確的酵母表達(dá)質(zhì)粒pESC-URA-caf1用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入S.cerevisiae INVSc1中.在無尿嘧啶的營養(yǎng)缺陷型平板上篩選,經(jīng)菌落PCR方法證明為陽性轉(zhuǎn)化子.陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明能穩(wěn)定傳代.根據(jù)宿主菌和重組菌在不同生長時(shí)期培養(yǎng)液