白介素-22改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病是一種由遺傳、環(huán)境和行為等多種致病因素導(dǎo)致的以慢性血糖升高為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病。
　　本研究以大鼠INS-1胰島β細(xì)胞為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平研究游離脂肪酸是否引起INS-1胰島β細(xì)胞的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及IL-22對(duì)其是否有保護(hù)作用，進(jìn)一步明確IL-22是否通過(guò)激活自噬途徑拮抗游離脂肪酸引起的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而為糖尿病的發(fā)病機(jī)制和防治策略提供新的理論依據(jù)和思維視角。
　　第一部分 游離脂肪酸對(duì)INS-1胰

2、島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響及白介素-22對(duì)其的作用
　　目的:
　　本部分實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠INS-1胰島β細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察游離脂肪酸對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有何影響，及IL-22對(duì)高脂影響下的胰島β細(xì)胞是否有保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組
　　探討不同濃度棕櫚酸(palmitate acid，PA)對(duì)INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響時(shí)按以下分組:空白對(duì)照組、BSA對(duì)照組、0.1mM PA組、0.25

3、mM PA組、0.5mMPA組、0.75mM PA組，分別作用細(xì)胞24h;探討PA作用不同時(shí)間對(duì)INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響時(shí)按以下分組:空白對(duì)照組、6h組、12h組、24h組、36h組、48h組，以0.5mM PA作用細(xì)胞;探討PA對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響時(shí)按以下分組:空白對(duì)照組、0.5mM PA組、NAC組，分別作用細(xì)胞24h;探討IL-22對(duì)PA作用下的INS-1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響時(shí)按以下分組:空白對(duì)照組、0.5mMPA

4、組、0.5mM PA+50ng/ml IL-22組，分別作用細(xì)胞24h。
　　2.INS-1細(xì)胞培養(yǎng)
　　復(fù)蘇大鼠INS-1胰島β細(xì)胞后，用含10％胎牛血清、50μmmol/Lβ-巰基乙醇、10mmol/L HEPES試劑、1mmol/L丙酮酸鈉，100mg/L鏈霉素和1×105IU/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞。2-3天換液或傳代一次。
　　結(jié)果:
　　1.PA對(duì)

5、INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　1.1 不同濃度PA對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　INS-1細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)24小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察0.1、0.25、0.5mM及0.75mM PA組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照及BSA對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而且0.1、0.25mM及0.5mM PA組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨PA的濃度升高而增強(qiáng)。
　　1.2 PA作用不同時(shí)間對(duì)INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　0.5mM PA分別作用INS-1

6、細(xì)胞6h、12h、24h、36h、48h后，熒光顯微鏡顯示，6h、12h、24h、36h、48h組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而且6h、12h及24h這三組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。
　　2.PA通過(guò)氧化應(yīng)激途徑對(duì)INS-1細(xì)胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　在以上PA作用不同濃度、不同時(shí)間對(duì)INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響實(shí)驗(yàn)中，我們得出0.5mM PA干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)是最合適的濃度和時(shí)間。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們使用該濃

7、度及時(shí)間為合適的干預(yù)條件。
　　各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)24h后，PA組的GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平分別為2.207±0.085，2.105±0.164，顯著高于空白對(duì)照組(0.979±0.040，1.088±0.057)(P＜0.05)，而NAC組的GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平分別為1.613±0.063，1.788±0.093，顯著低于PA組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　PA能以劑量及時(shí)間依賴性誘導(dǎo)INS-1

8、胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)，并且通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78、CHOP的表達(dá)增多;而加入IL-22后，PA引起的INS-1胰島β細(xì)胞內(nèi)ROS含量及GRP78、CHOP等表達(dá)水平明顯減少。本部分實(shí)驗(yàn)證明IL-22對(duì)PA誘導(dǎo)的INS-1胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有保護(hù)作用。
　　第二部分 白介素-22對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)INS-1胰島β細(xì)胞氧化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制
　　目的:
　　通過(guò)上

9、述實(shí)驗(yàn)我們觀察到IL-22對(duì)PA誘導(dǎo)的INS-1胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有保護(hù)作用，本部分實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步明確該保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，為防治糖尿病提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬的超微結(jié)構(gòu)
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組;PA組（含0.5mM PA）;PA+IL-22組（含0.5mM PA及50ng/mlIL-22）。將INS-1細(xì)胞培育于六孔板中，各孔同步化處理后按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞24h

10、。丟棄培養(yǎng)液并用PBS溶液洗滌2次后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞并離心。沿管壁緩慢加入3％戊二醛溶液于4℃固定2h后，漂洗三次。然后，用丙酮梯度脫水和1％醋酸鈾塊染2小時(shí)，完全浸滲后用環(huán)氧樹脂包埋。接著將標(biāo)本超薄切片，并用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。最后，置于透射電子顯微鏡下觀察并攝片。
　　2.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3B的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)分組同上。各孔同步化處理后按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)細(xì)胞24小時(shí)后，丟棄細(xì)胞培養(yǎng)液并漂洗3次。然后用4％多聚

11、甲醛固定后，用PBS溶液洗滌3次。封閉后，用1％B SA稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜。漂洗3次后，加入1％B SA稀釋的相應(yīng)二抗于室溫孵育1h。漂洗三次后加入5μg/ml DAPI染色2min，并用抗淬滅封片劑封片。最后，利用熒光顯微鏡觀察、拍照。
　　具體方法同第一章。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　同第一章。
　　結(jié)果:
　　1.IL-22可誘導(dǎo)PA作用下的INS-1細(xì)胞的自噬發(fā)生
　　1.1 透射電子顯微鏡觀

12、察細(xì)胞內(nèi)自噬的超微結(jié)構(gòu)
　　各組細(xì)胞干預(yù)24h，利用透射電子顯微鏡可見，在空白對(duì)照組，細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)空泡化改變，僅可見少量自噬;在PA組（含0.5mM PA）可見自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增多，線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器較空白對(duì)照組腫脹，且胞質(zhì)出現(xiàn)輕微空泡化改變;在PA+IL-22組(含0.5mM PA及50ng/ml IL-22)中，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化改變，并出現(xiàn)大量包含細(xì)胞內(nèi)容物及細(xì)胞器的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。
　

13、　1.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)LC3B蛋白的表達(dá)水平
　　用細(xì)胞免疫熒光法觀察INS-1細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3B的表達(dá)情況:LC3B為綠色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色。各組細(xì)胞干預(yù)24h后，利用熒光顯微鏡，可見PA+IL-22組細(xì)胞內(nèi)LC3B的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組及PA組。
　　1.3 IL-22上調(diào)PA作用下的INS-1細(xì)胞內(nèi)Beclin-1及LC3B蛋白的表達(dá)水平
　　各組細(xì)胞干預(yù)24h后，western blot結(jié)果顯示:PA+

14、IL-22組的Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平分別為2.177+0.166，1.464±0.105，顯著高于空白對(duì)照組（0.629±0.065，0.118±0.004）及PA組(1.071±0.084，0.773±0.091)(P＜0.05)。
　　2.IL-22通過(guò)自噬途徑減輕PA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　2.1 IL-22通過(guò)自噬途徑減輕PA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激
　　INS-1細(xì)

15、胞按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)24小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察PA組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而PA+IL-22組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比PA組顯著減少。然而，在PA+IL-22+3-MA組，IL-22的上述作用可被逆轉(zhuǎn)，該組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比PA+IL-22組顯著增強(qiáng)。
　　用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PA組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量（DCFH平均熒光強(qiáng)度）是370.467±25.461，顯著高于空白對(duì)照組(100.000±3.657)(P=0.000)。

16、PA+IL-22組細(xì)胞的ROS含量為164.377±16.999，與PA組相比顯著降低(P=0.000)。然而，加入自噬阻斷劑3-MA后，IL-22的上述作用可被逆轉(zhuǎn)，PA+IL-22+3-MA組細(xì)胞的ROS含量為283.853±8.530，比PA+IL-22組顯著增加(P=0.000)。
　　2.2 IL-22通過(guò)自噬途徑減輕PA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　INS-1細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)24h后，western b

17、lot結(jié)果顯示:PA組的GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平分別為2.520±0.027，2.546±0.054，顯著高于空白對(duì)照組(1.136±0.013，1.115±0.019)(P＜0.05)。PA+IL-22組細(xì)胞的GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平分別為1.671±0.062，1.529±0.015，與PA組相比顯著降低(P＜0.05)。然而，加入自噬阻斷劑3-MA后，IL-22的上述作用可被逆轉(zhuǎn)，PA+IL-22+3-MA組細(xì)胞的