豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的表達(dá)及抗體ELISA方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的主要病原,也被證明與豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)、繁殖障礙等多種豬圓環(huán)病毒病相關(guān)。PCV2的ORF2基因編碼的Cap蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,具有良好的免疫原性,是機(jī)體抵抗PCV2感染的主要免疫原。
　　 本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了兩株能表達(dá)PCV2C

2、ap蛋白的重組桿狀病毒。首先克隆了ORF2△41基因,即缺失ORF2編碼蛋白前41個(gè)氨基酸的核定位序列的ORF2基因、蜂毒肽基因(MEL基因)以及六聚組氨酸標(biāo)簽基因(6H基因),并引入合適的酶切位點(diǎn),將其插入FastBacTM1轉(zhuǎn)移載體,獲得了兩個(gè)重組載體質(zhì)粒,一個(gè)為插入了兩個(gè)串聯(lián)的ORF2基因載體質(zhì)粒;命名為FBDORF2。另一個(gè)為插入了單獨(dú)的ORF2基因的載體質(zhì)粒,命名為FBSORF2。然后將兩個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿

3、菌感受態(tài)細(xì)胞,同源重組后使目的片段轉(zhuǎn)移到重組桿粒DNA(Bacmid DNA)上。再分別以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染到sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒,分別命名為DORF2和SORF2。經(jīng)PCR和測序鑒定,成功獲得了兩株重組桿狀病毒。病毒滴度測得DORF2毒的TCID50為10-6.33/mL;SORF2毒的TCID50為10-6/mL。
　　 將兩株重組桿狀病毒接種sf9細(xì)胞,72小時(shí)后進(jìn)行PCV2和六聚組氨酸標(biāo)簽的熒光

4、抗體染色,結(jié)果顯示,兩株重組桿狀病毒的均能見明顯的剛性細(xì)胞,說明所構(gòu)建的桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)。以兩株重組桿狀病毒分別感染懸浮培養(yǎng)的TriExsf9細(xì)胞,培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞上清液,上清液經(jīng)過濾后使用鎳柱進(jìn)行親和層析純化Cap蛋白。經(jīng)SDS-PAGE鑒定,兩株病毒的表達(dá)產(chǎn)物分別在約51KDa處和28KDa處有較單一且明顯的條帶,與預(yù)期大小基本一致,且DORF2毒株的表達(dá)量高于SORF2;Western-blot印跡表明,兩個(gè)病毒

5、表達(dá)的Cap蛋白均能與PCV2陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)。
　　 以純化的Cap蛋白為基礎(chǔ),初步建立了檢測PCV2抗體的間接ELISA檢測方法。確定了ELISA反應(yīng)的幾個(gè)最佳反應(yīng)條件:Cap蛋白的最佳包被濃度為0.31μg/mL;待檢血清最佳稀釋度為100倍稀釋;最適酶標(biāo)二抗的工作濃度為20000倍稀釋;最適包被條件為4℃16小時(shí);最佳封閉液為10％脫脂奶粉的PBS溶液;特異性試驗(yàn)證明,該方法與PRV、PPV、CSFV、PRRSV、豬