大鼠肌肉挫傷后組織中時(shí)間相關(guān)基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的: 運(yùn)用差異顯示技術(shù)結(jié)合硝酸銀染色篩選大鼠肌肉挫傷后與正常肌肉表達(dá)差異的基因，并通過(guò)Real—timePCR方法研究差異基因與損傷時(shí)間的關(guān)系，旨在尋找一種或幾種與損傷相關(guān)的敏感基因，為法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間推斷提供科學(xué)、有效的指標(biāo)。 方法: 1. 12只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠建立肌肉挫傷模型，損傷后4小時(shí)處死，提取100mg損傷處肌肉組織。對(duì)照組大鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)處死，提取相同部位100mg肌肉

2、組織。兩組肌肉組織經(jīng)SV Total RNA Isolation system提取總RNA，并經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)，SIN值大于8.0的樣本經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后用于下游實(shí)驗(yàn)。 2．采用4種錨定引物和3種隨機(jī)引物共12種組合對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后硝酸銀染色進(jìn)行差異表達(dá)分析。采用煮沸法回收差異條帶，并進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與載體連接、克隆，進(jìn)行

3、序列分析，將測(cè)序所得差異序列與GenBank進(jìn)行同源性比較。 3.4只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷組，提取各組樣本的總RNA。在差異序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物，采用SYBR()GreenⅠ染料法進(jìn)行Real—timePCR擴(kuò)增，通過(guò)分析擴(kuò)增曲線及溶解曲線，鑒定差異表達(dá)基因的真?zhèn)巍?4.12只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、損傷后6小時(shí)組和損傷后12小時(shí)組。采用Real—timePCR檢測(cè)正常肌肉組織、損傷后6

4、小時(shí)肌肉組織和損傷后12小時(shí)肌肉組織中β—Actin等九種常用內(nèi)參基因的表達(dá)水平，通過(guò)Normfinder、geNorm和BestKeeper三種軟件分析九種常用內(nèi)參基因在肌肉組織損傷后表達(dá)的穩(wěn)定性，尋找合適的內(nèi)參基因。 5.54只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和損傷組，建立不同損傷時(shí)間大鼠肌肉挫傷模型，提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄后采用差異基因的上下游特異性引物進(jìn)行Real—timePCR擴(kuò)增，分析差異基因與損傷時(shí)間的關(guān)系。

5、 結(jié)果: 1．采用Progema公司的SV Total RNA Isolation System提取的總RNA具有較高的RIN值，且沒(méi)有DNA及蛋白質(zhì)的污染。各樣本RIN值在8.3～8.8之間，均大于8.0。每個(gè)樣本都可見(jiàn)清晰的18s及28s峰，在18s峰之前基線平坦，沒(méi)有降解的RNA片段出現(xiàn)。28s峰之后，基線也比較平直，說(shuō)明沒(méi)有基因組DNA及蛋白質(zhì)的污染，可以保證后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 2．經(jīng)過(guò)對(duì)21條感興趣的差異

6、條帶進(jìn)行回收及再擴(kuò)增，共有12條差異條帶得到成功回收。DNA重組、轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選重組成功的載體，經(jīng)序列分析有5條差異條帶片段較長(zhǎng)，其他條帶片段較短，多數(shù)為引物二聚體序列。 3．經(jīng)過(guò)與GenBank進(jìn)行同源性比較及Real—timePRC鑒定，5條差異性片段均從總RNA中得到了有效擴(kuò)增，且溶解曲線均為單一峰型，說(shuō)明均為陽(yáng)性差異片段。其中3條為已知基因，與sTnI、Mx2及Cox6c匹配度較高，另外兩條可能為新基因，有待于進(jìn)一步研

7、究。 4．通過(guò)Real—timePCR的方法測(cè)定損傷后不同時(shí)間點(diǎn)肌肉組織中常用內(nèi)參基因的CT值，經(jīng)geNorm、Normfinder及BestKeeper軟件分析，得出RPL13和RPL32在肌肉組織損傷后表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可以作為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行均一化處理。而常用的β—Actin及GAPDH在不同損傷時(shí)間肌肉組織中表達(dá)不穩(wěn)定。 5、經(jīng)Real—timePCR分析，sTnI mRNA在損傷后表達(dá)逐漸降低，在0.5h、1

8、h、6h sTnImRNA表達(dá)量分別為正常組的78.17％、41.58％、32.13％，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，6h～36h sTnI mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Mx2 mRNA在損傷后0.5小時(shí)表達(dá)驟然升高達(dá)到正常對(duì)照組的84.3倍，隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸下降，損傷后18小時(shí)降低到正常對(duì)照組的0.65倍，在損傷后24小時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)表達(dá)高峰，達(dá)正常對(duì)照組的37.1倍，隨后又逐漸下降。

9、Frag-3 mRNA在損傷早期隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增高，損傷后6小時(shí)其表達(dá)量高達(dá)正常對(duì)照組的243.5倍，損傷后12小時(shí)恢復(fù)到接近正常表達(dá)量水平，損傷后18小時(shí)，又出現(xiàn)一個(gè)小的表達(dá)高峰，為正常對(duì)照組的11.38倍，隨后又下降至正常組水平。肌肉挫傷后Cox6c mRNA表達(dá)量的變化幅度較小，在正常組表達(dá)量的0.24～1.57倍之間。損傷后0.5小時(shí)，Cox6c mRNA表達(dá)量最高，為正常對(duì)照組的1.57倍。隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量

10、逐漸減少，在1小時(shí)和6小時(shí)分別為正常對(duì)照組的1.29倍和1.19倍。損傷后18小時(shí)，其表達(dá)量已降至正常組水平以下，30小時(shí)表達(dá)量最低，為正常對(duì)照組的0.24倍。Frag-5 mRNA在肌肉損傷后36小時(shí)內(nèi)均呈現(xiàn)相對(duì)高表達(dá)的狀態(tài)。損傷的初始階段其表達(dá)量迅速升高，0.5小時(shí)達(dá)到正常對(duì)照組的5.7倍，1小時(shí)達(dá)到一個(gè)高峰，為正常對(duì)照組的6.19倍。隨后開(kāi)始下降，12小時(shí)達(dá)到最低表達(dá)量，為正常對(duì)照組的1.2倍。在18小時(shí)達(dá)到又一個(gè)高峰，為正常對(duì)照