破骨細(xì)胞外泌小體促進(jìn)成骨前體細(xì)胞成骨分化的初步研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松（OP）發(fā)病的病理機(jī)制為破骨細(xì)胞（OC）骨吸收的速率超過成骨細(xì)胞（OB）骨生成能力，從而導(dǎo)致負(fù)性骨平衡。人體骨骼持續(xù)不斷地進(jìn)行更新和重建，從而維持骨的新舊交替、保持骨骼強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)平衡。這一骨重建過程，依賴于OC的骨吸收和 OB的骨形成兩個(gè)過程精確協(xié)調(diào)。近年來大量研究已從細(xì)胞水平展示了 OC和 OB之間相偶聯(lián)的奇妙關(guān)系，它們經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外多途徑精確信號(hào)調(diào)控，涉及正負(fù)反饋環(huán)和雙向作用機(jī)制，從而維持骨穩(wěn)態(tài)。外泌小體（exosomes）是由

2、細(xì)胞內(nèi)多泡體（multivesicular body。MVB）與細(xì)胞膜融合后,釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約60-100nm的膜性囊泡，參與細(xì)胞間的信息交流及多種生理病理過程。它可由淋巴細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞所分泌。既往的研究已證明外泌小體在骨髓瘤、骨肉瘤、帕金森病、阿爾茨海默癥、結(jié)直腸癌等疾病方面具有重要作用。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)破骨細(xì)胞來源外泌小體的研究報(bào)道較少，對(duì)破骨細(xì)胞外泌小體的生物學(xué)特性及其在成骨分化方面功能機(jī)制的研

3、究可為骨質(zhì)疏松、骨硬化等多種代謝性骨骼疾病的防治提供新的思路及方向。
　　目的：分離鑒定破骨細(xì)胞外泌小體（exosomes），觀察破骨細(xì)胞外泌小體在成骨前體細(xì)胞（kusao細(xì)胞）成骨分化中的作用，明確破骨細(xì)胞外泌小體是否促進(jìn)了kusao細(xì)胞的成骨分化，尋找破骨細(xì)胞外泌小體促進(jìn)成骨分化的關(guān)鍵因子。
　　方法：
　　1、用RANKL誘導(dǎo)因子對(duì)Raw264.7細(xì)胞進(jìn)行破骨誘導(dǎo)，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色鑒定；2、用超濾離

4、心法從破骨細(xì)胞上清液中分離破骨細(xì)胞外泌小體（OC-exosomes）；3、Western blot檢測(cè)外泌小體（exosomes）特征蛋白CD9、CD63的表達(dá)并對(duì)其進(jìn)行Nanosight粒度分析；4、觀察PKH67標(biāo)記的外泌小體靶定受體細(xì)胞kusao；5、將kusao細(xì)胞分成3組，完全培養(yǎng)基組（CM組），成骨誘導(dǎo)液組（OM組），成骨誘導(dǎo)液+破骨細(xì)胞外泌小體組（OME組），隔天換液，培養(yǎng)14天后通過Western blot、茜素紅染色、

5、Von kossa銀染色、q-PCR檢測(cè)等，明確破骨細(xì)胞外泌小體在kusao細(xì)胞成骨分化中的作用；6、運(yùn)用蛋白組學(xué)分析方法分析破骨細(xì)胞外泌小體，尋找出關(guān)鍵蛋白并通過Western blot、q-PCR檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1、TRAP染色可見紅色多核、體積大、形狀不規(guī)則的TRAP陽性巨細(xì)胞，即為破骨細(xì)胞；2、破骨細(xì)胞上清液中檢測(cè)到大小均一、直徑約為50-200nm的膜性微囊泡結(jié)構(gòu)，經(jīng)Western blot檢測(cè)證

6、實(shí)其表達(dá)外泌小體特征蛋白CD9、CD63，鑒定為破骨細(xì)胞外泌小體；3、PKH67標(biāo)記的破骨細(xì)胞外泌小體能靶定受體kusao細(xì)胞；4、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示OM組RUNX2蛋白的表達(dá)量是CM組的1.25倍、OME組的2.72倍。5、茜素紅染色結(jié)果顯示CM組、OM組、OME組的鈣鹽沉積面積占總面積的比值分別為：0.21％、3.47%、20.74%；6、Von kossa銀染色結(jié)果顯示CM組、OM組、OME組的鈣鹽沉積面積占總面

7、積的比值分別為：0.066%、2.64%、20.89%；7、q-PCR結(jié)果分析顯示：①OME組RUNX2的表達(dá)量明顯較 OM、CM組少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；②OME組 SPP1的表達(dá)量較OM、CM組少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；8、蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞外泌小體中MMP9的表達(dá)量是Raw264.7細(xì)胞外泌小體的13.552倍；9、Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示MMP9蛋白的表達(dá)量在OC-exosom

8、e組明顯高于 RC-protein、OC-protein組（P<0.01）；10、q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)14天后，與成骨誘導(dǎo)液組（OM組）相比，成骨誘導(dǎo)液+破骨細(xì)胞外泌小體組（OME組）的MMP9基因表達(dá)明顯上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、應(yīng)用超濾離心法成功從破骨細(xì)胞上清液中分離出外泌小體；2、破骨細(xì)胞外泌小體具有促進(jìn)成骨前體細(xì)胞（kusao細(xì)胞）成骨分化的作用；3、破骨細(xì)胞外泌小體中高表