microRNA-21參與鍶促細(xì)胞成骨分化及外泌體提取方法改良.pdf

1、目的：鍶(Sr)是人體內(nèi)一種重要的微量元素，在元素周期表中與鈣同族，具有相似的化學(xué)性質(zhì)。作為骨的重要成分，由于具有促進(jìn)骨生成和抑制骨吸收的雙重作用，鍶及相關(guān)生物材料在骨質(zhì)疏松治療及骨缺損填充中的應(yīng)用受到高度關(guān)注，比如雷奈酸鍶廣泛的應(yīng)用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。到目前為止，關(guān)于鍶作用機(jī)制的探討已經(jīng)深入到分子層次，包括：鍶與細(xì)胞膜上的鈣受體或其它受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和成熟行為，進(jìn)而促進(jìn)骨基質(zhì)的合成等，但鍶具體作用機(jī)制，仍需

2、要進(jìn)一步完善。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNA是調(diào)控成骨分化的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，對(duì)成骨細(xì)胞的分化發(fā)育具有重要調(diào)控作用，包括正性和負(fù)性雙重調(diào)節(jié)作用，但miRNA這一重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子是否也在鍶促進(jìn)成骨分化機(jī)制中發(fā)揮作用尚不明確。本課題就鍶促進(jìn)細(xì)胞成骨分化過(guò)程中miRNA-21表達(dá)變化以及其在鍶促進(jìn)成骨分化過(guò)程中的作用加以探討。外泌體（exosome）是具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的膜源性小囊泡，直徑多介于30-100 nm，可以由多種細(xì)胞合成。外泌體內(nèi)含有

3、不同種類的 microRNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、tRNAs、信號(hào)分子等生物學(xué)活性物質(zhì)，易與鄰近細(xì)胞膜發(fā)生融合，將生物學(xué)活性物質(zhì)選擇性地遞呈至受體細(xì)胞，從而完成信息傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮生物學(xué)功能。鍶促進(jìn)成骨分化過(guò)程中，外泌體是否也發(fā)揮重要調(diào)控機(jī)制尚不清楚，而獲得高純度、無(wú)丟失的外泌體樣本是進(jìn)一步探尋該機(jī)制的研究基礎(chǔ)。因此本課題同時(shí)就外泌體提取方法的改良比較進(jìn)行探討，為外泌體深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:一、采用

4、不同濃度（0,1,3,6,9,12 mM）的氯化鍶（SrCl2）溶液對(duì)小鼠前成肌細(xì)胞C2C12進(jìn)行成骨誘導(dǎo)72h，MTT法檢測(cè)不同濃度鍶對(duì)細(xì)胞增殖的影響作用，確定適宜的鍶誘導(dǎo)濃度；實(shí)驗(yàn)組以1mM和3mM鍶誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞，對(duì)照組培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同，但不加鍶誘導(dǎo)，72h后分別提取細(xì)胞總蛋白和總RNA，以蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）檢測(cè)成骨標(biāo)志phospho1蛋白表達(dá)水平變化，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)phos

5、pho1以及microRNA-21基因表達(dá)情況；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞均培養(yǎng)7d后，進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色；對(duì)C2C12細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor，6h后加入3mM鍶誘導(dǎo)72h，檢測(cè)phospho1基因以及蛋白表達(dá)情況；以PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)細(xì)胞預(yù)處理2h，隨后加入3mM鍶誘導(dǎo)72h，檢測(cè)phospho1基因及蛋白表達(dá)水平改變。
　　二、分別用ExoQuick試劑盒及改良方法、超速

6、離心法提取血清外泌體。利用透射電鏡對(duì)外泌體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；樣本進(jìn)行2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量；Western blotting檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物CD63；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析樣本蛋白表達(dá)差異。
　　結(jié)果：一、MTT結(jié)果顯示，低濃度鍶（1,3mM）誘導(dǎo)細(xì)胞后，其增殖情況與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（p＞0.05），而較高濃度的鍶（6,9,12mM）對(duì)細(xì)胞增殖具有一定的損害

7、作用（p＜0.05），因此本課題采用低濃度鍶誘導(dǎo) C2C12細(xì)胞成骨分化；分別以1mM和3mM鍶對(duì)C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)72h后，phospho1基因和蛋白表達(dá)均升高（p＜0.05），且3mM鍶對(duì)C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨分化作用較1mM鍶明顯；同時(shí)檢測(cè)小RNA miR-21發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)也較對(duì)照組明顯上調(diào)（p＜0.05）；對(duì)C2C12細(xì)胞進(jìn)行miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染后，鍶促進(jìn)成骨作用消失，phospho1基因以及蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（

8、p＜0.05）；以PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對(duì)細(xì)胞預(yù)處理后，同樣抑制了鍶對(duì)C2C12的誘導(dǎo)成骨作用，phospho1基因和蛋白表達(dá)水平下降。
　　二、ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法均可獲得血清 exosome，電鏡下可觀察到圓形或橢圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu)；傳統(tǒng)超速離心法提取樣本蛋白濃度顯著低于ExoQuick試劑盒法及其改進(jìn)方法（P＜0.05）；SDS-PAGE顯示三種方法提取樣本蛋白表達(dá)強(qiáng)度及豐度存在差異

9、；western blotting表明三種方法提取的外泌體均表達(dá)表面特異性標(biāo)志物 CD63，且含同濃度蛋白的情況下，ExoQuick Precipitation及改良法其CD63含量明顯高于傳統(tǒng)超速離心法。
　　結(jié)論：一、低濃度的鍶對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性且具有明顯的促成骨作用。結(jié)果表明，鍶可通過(guò)上調(diào)miR-21促進(jìn)PI3K/AKT通路活化以促進(jìn)促成骨因子phsopho1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞成骨。
　　二、ExoQuick試劑盒及改良方法