MiR-106b在ATD致粒細胞缺乏發(fā)生中的作用及機制.pdf

1、第一部分 MiR-106b對粒細胞細胞生物學性狀的影響
　　目的：觀察miR-106b的表達水平變化對人早幼粒白血病細胞株(HL-60)細胞生物學特性的影響。
　　方法：采用miR-106b的類似物miR-106b mimic（高表達組），抑制物miR-106b inhibitor（低表達組）及miR-106b control（對照組）轉(zhuǎn)染HL-60細胞，qRT-PCR檢測各組細胞miR-106b表達變化。分別于轉(zhuǎn)染后第24

2、 h、48 h、72 h收集細胞，MTT比色法檢測三個組細胞增殖情況，流式細胞儀結(jié)合 AnnexinV/PI雙染色檢測細胞的凋亡率。
　　結(jié)果：qRT-PCR檢測高表達組、低表達組、對照組miR-106b的表達水平發(fā)現(xiàn)：低表達組miR-106b表達量在48 h、72 h分別是對照組的0.53和0.45倍（P<0.05），高表達組miR-106b表達量是對照組的1.52和1.56倍（P<0.05）。MiR-106b inhibito

3、r轉(zhuǎn)染HL-60細胞48 h、72 h后，細胞增殖較對照組明顯被抑制（P＜0.05），而高表達組、對照組及正常組三組間細胞增殖狀況無明顯差異。同時miR-106b低表達組較對照組HL-60細胞凋亡明顯增加（P＜0.05）。
　　結(jié)論：MiR-106b低表達可抑制粒細胞增殖，促進其凋亡。
　　第二部分 MiR-106b調(diào)控粒細胞凋亡的機制研究
　　目的：研究miR-106b調(diào)控HL-60細胞凋亡的靶向調(diào)控基因及其作用的細

4、胞內(nèi)信號通路。
　　方法：通過在線核酸數(shù)據(jù)庫（Genebank）檢索獲取miR-106b的成熟序列，預測與細胞凋亡信號通路密切相關(guān)的靶向基因及其3’非編碼區(qū)結(jié)合位點（3’UTR）、預測 miR-106b與靶基因結(jié)合自由能等生物信息。通過構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體，進行熒光素酶實驗鑒定檢測軟件預測的靶基因。運用RT-PCR和Western blot檢測實驗各組預測靶基因mRNA及蛋白的表達變化。并采用Western blot檢測靶蛋

5、白的下游調(diào)控蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：在成功獲取miR-106b成熟序列和PTEN3’UTR序列基礎(chǔ)上，通過在線軟件分析證實miR-106b與PTEN有理想的相互作用位點及較低的結(jié)合自由能。miR-106b mimic與野生型psiCHECK?-2-PTEN-WT3’UTR共轉(zhuǎn)染后抑制熒光素酶活性，而突變型psiCHECK?-2-PTEN-Mut3’UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性無明顯變化。與對照組相比較，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)抑制