MiR-106b在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)破壞中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種累及關(guān)節(jié)的慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)破壞。RA的發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)的異常在RA的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。MiR-106b是新近發(fā)現(xiàn)的一種 miRNA，既往研究證實(shí)其在肺癌、胃癌、肝癌和腎癌等組織中高表達(dá)，主要作為一種癌基因發(fā)揮作用；近年來miR-106b在炎癥、骨改建以及免疫調(diào)節(jié)中的作用也

2、逐漸引起重視。本研究在成功制備牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型基礎(chǔ)上，研究調(diào)控miR-106b對(duì)小鼠CIA的治療作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　目的：探討靶向干預(yù) miR-106b對(duì) RA骨關(guān)節(jié)破壞的治療作用，并進(jìn)一步明確miR-106b調(diào)控RA發(fā)生的機(jī)理。
　　方法：雄性DBA/1小鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：對(duì)照組（Sham組），慢病毒載體組（

3、NC組），miR-106b mimic組（Mimic組）和miR-106b inhibitor組(Inhibitor組)，每組10只小鼠。NC組，Mimic組和Inhibitor組在第二次免疫前1天（D20）分別經(jīng)眼眶注射空慢病毒載體、miR-106b mimic和miR-106b inhibitor，劑量為200μl（1×108U/ml）；Sham組注射200μl生理鹽水。觀察小鼠的體重、足掌厚度，并對(duì)關(guān)節(jié)炎的腫脹程度進(jìn)行評(píng)分（每三天

4、1次）。D56處死小鼠，Micro-CT檢查評(píng)估骨組織破壞程度，H&E染色評(píng)估滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，番紅O染色檢測(cè)軟骨破壞程度，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色檢測(cè)成熟破骨細(xì)胞，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）以及核因子-κB受體活化因子配體（re

5、ceptor activators of nuclear factor- kappa B ligand，RANKL）和骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）的表達(dá)變化；RT-PCR檢測(cè)CIA小鼠膝關(guān)節(jié)中miR-106b的表達(dá)變化；ELISA法檢測(cè)外周血中抗Ⅱ型膠原（collagenⅡ，CⅡ）抗體，TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、RANKL和OPG水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及T細(xì)胞

6、亞群變化。
　　結(jié)果：NC和Mimic組小鼠D21開始，體重明顯下降，與Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Inhibitor組在D35時(shí)升高小鼠體重，在D42時(shí)，小鼠體重明顯恢復(fù)，與NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。D21開始CIA小鼠足爪出現(xiàn)較明顯的紅腫并逐漸加重，Inhibitor組小鼠足爪紅腫逐漸減輕，D49足掌厚度為（2.58±0.09)mm、關(guān)節(jié)炎評(píng)分為（10.2±0.98）與NC組[（3.06±0.07）m

7、m，（13.8±1.65）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。Micro-CT掃描結(jié)果顯示NC和Mimic組有明顯的骨質(zhì)破壞，抑制miR-106b后骨質(zhì)破壞明顯減輕；Inhibitor組骨體積（BV）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨面積分?jǐn)?shù)（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）分別為6.85±0.24 mm3、22.52±0.62％、9.46±2.02mm-1、0.31±0.06 mm，與NC組（5.61±0.35 mm3、16.2

8、6±1.42%、13.32±1.85 mm-1、0.24±0.06 mm）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。H&E染色結(jié)果顯示CIA小鼠關(guān)節(jié)腔可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜增生明顯；靶向阻斷miR-106b后滑膜組織炎癥明顯減輕。番紅O染色結(jié)果提示NC組和Mimic組軟骨細(xì)胞大量壞死，局部軟骨層幾乎完全消失，Inhibitor組軟骨細(xì)胞增多，軟骨層結(jié)構(gòu)較完整，軟骨破壞評(píng)分（0.92±0.37）明顯優(yōu)于 NC組（2.5±0.51），差異

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。TRAP染色結(jié)果顯示CIA小鼠關(guān)節(jié)破壞局部有大片紫紅色深染區(qū)域，Inhibitor組僅可見少量陽性染色區(qū)域，提示miR-106b inhibitor能夠抑制破骨細(xì)胞活化。定量RT-PCR結(jié)果顯示miR-106b在CIA小鼠膝關(guān)節(jié)中高表達(dá)，miR-106b inhibitor能明顯降低miR-106b在小鼠膝關(guān)節(jié)中的表達(dá)，與NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示抑制miR-10

10、6b能減少TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和RANKL的表達(dá)，增加 OPG的表達(dá)。血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，與 Sham組比較，CIA小鼠血清中抗CⅡ抗體水平明顯升高，miR-106b inhibitor治療后，抗CⅡ抗體含量降為（89.51±19.32ng/L），與NC組（118.53±11.32 ng/L）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。CIA小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2的含量明顯增加

11、，miR-106b inhibitor能抑制上述因子的表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示，miR-106b inhibitor能促進(jìn)OPG的分泌，抑制RANKL的表達(dá)，使RANKL/OPG比值明顯降低，與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CIA小鼠脾臟中CD11b+巨噬細(xì)胞、CD11c+樹突狀細(xì)胞和GR1+中性粒細(xì)胞比例顯著增高；同時(shí)CD4+、CD28+、CD154+T細(xì)胞比例也明顯增高，而CD8+T細(xì)胞比例減少，CD

12、4+/CD8+比值上升。miR-106b inhibitor治療組能顯著降低脾臟中CD11b+、CD11c+、CD11c+以及CD4+、CD28+、CD154+T細(xì)胞比例，同時(shí)升高CD8+T細(xì)胞比例，恢復(fù)CD4+/CD8+比值。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究顯示抑制miR-106b的表達(dá)可以減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破壞；抑制miR-106b能減少CIA小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的分布；抑制miR-106b能調(diào)節(jié)CIA小