miR-10b在人肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制的初步探索.pdf

1、背景:肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一個(gè)多因素、多途徑的復(fù)雜病變過(guò)程，具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、死亡率高的特點(diǎn)。因此，盡快從分子水平闡明HCC的發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防、診斷和治療至關(guān)重要。探索染色體畸變和相關(guān)基因異常已成為腫瘤研究的重要切入點(diǎn)。其中，癌基因的過(guò)表達(dá)和抑癌基因的缺失或低表達(dá)是HCC發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，促進(jìn)了腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)性狀。因此，積極尋找新的診斷標(biāo)記物、發(fā)現(xiàn)有效的作用靶點(diǎn)、探

2、索HCC的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，越來(lái)越多的受到人們的關(guān)注。
　　微小RNA（microRNA）（以下簡(jiǎn)稱miRNA）是一類由17-25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。成熟的miRNA與RNA沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex,RISC）形成RISC-miRNA復(fù)合物。復(fù)合物與靶基因信使RNA（messenger RNA,mRNA）的3’-非翻譯區(qū)（untranslated re

3、gion,UTR）不完全配對(duì)結(jié)合調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNA具有組織、時(shí)序特異性，不同的腫瘤呈現(xiàn)出特異的miRNA表達(dá)譜，這為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的可行的標(biāo)記物和治療干預(yù)靶點(diǎn)。目前，關(guān)于HCC相關(guān)miRNA表達(dá)譜的研究越來(lái)越多，并且報(bào)道了一些與HCC鑒別診斷、預(yù)后評(píng)估、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)的miRNA，以此為臨床應(yīng)用提供新的、具有可行性和可操作性的科學(xué)依據(jù)。
　　通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)中的miRNA表達(dá)譜篩選和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)m

4、iR-10b在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，但在HCC中的表達(dá)變化及功能研究相對(duì)匱乏。miR-10b定位于2號(hào)染色體的HOX基因簇，推測(cè)其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過(guò)相關(guān)生物信息學(xué)方法及軟件進(jìn)行搜索、比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)CSMD1（CUB and Sushi multiple domains1）可能是miR-10b的靶基因。CSMD1是一個(gè)單次跨膜蛋白，位于氨基端的胞外區(qū)包含CUB和Sushi結(jié)構(gòu)域，其功能可能與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-配體的相互

5、作用有關(guān)，并且該區(qū)域有信號(hào)肽的存在；位于羧基端的胞漿區(qū)由63個(gè)氨基酸殘基組成，有三個(gè)磷酸化位點(diǎn)。這表明CSMD1可能是膜受體或粘附因子，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而參與HCC的發(fā)生、進(jìn)展。近年來(lái)的研究顯示，CSMD1是一個(gè)新候選的腫瘤抑制基因，但其在HCC中的研究極少。因此，我們首次在HCC中進(jìn)行了miR-10b和CSMD1的相互關(guān)系及功能機(jī)制的研究，以闡明它們?cè)贖CC過(guò)程中的作用，從而為HCC的診斷和治療提供新的候選基因和作用靶點(diǎn)。

6、　　目的:檢測(cè)miR-10b在HCC組織中的表達(dá)，并闡明miR-10b與CSMD1在HCC中的相互關(guān)系及功能機(jī)制，為HCC的診斷和治療提供新的候選基因和作用靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.利用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)miR-10b在HCC組織中的表達(dá)水平；
　　2.利用 qRT-PCR檢測(cè)miR-10b在

7、正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，篩選出miR-10b表達(dá)與HCC組織相一致的細(xì)胞系；采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR-10b mimic、inhibitor及各自相應(yīng)的陰性對(duì)照，分別進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)，并用流式細(xì)胞儀測(cè)定其對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響，觀察miR-10b對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響；
　　3.采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，在瘤內(nèi)多點(diǎn)注射agomir-10b及其陰性對(duì)照

8、，觀察miR-10b在體內(nèi)環(huán)境對(duì)腫瘤生長(zhǎng)性狀的影響；
　　4.采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-10b和CSMD1之間是否存在直接負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并明確其結(jié)合位點(diǎn)；利用qRT-PCR和免疫組化驗(yàn)證CSMD1和miR-10b在mRNA水平和蛋白水平是否存在負(fù)向表達(dá)調(diào)控關(guān)系；
　　5.采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染CSMD1的siRNA及其陰性對(duì)照，利用qRT-PCR和細(xì)胞免疫組化檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)，

9、觀察CSMD1對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響；在免疫組化水平檢測(cè)臨床HCC病例中CSMD1的表達(dá)情況，分析CSMD1在HCC中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.與非腫瘤肝組織相比，miR-10b在 HCC組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)（-1.4590±0.69542 vs.-1.7312±0.62758,p<0.01），且miR-10b的表達(dá)水平與患者年齡、HBV感染有相關(guān)性；
　　2. MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10、顯示miR-10b促進(jìn)細(xì)胞增殖；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-10b促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示miR-10b促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡；
　　3.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，agomir-10b組腫瘤生長(zhǎng)更快，體積更大；
　　4.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-10b對(duì)CSMD13’UTR有直接負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，結(jié)合位點(diǎn)為707-713位點(diǎn)；qRT-PCR和免疫組化結(jié)果顯示miR

11、-10b與CSMD1之間呈負(fù)表達(dá)調(diào)控關(guān)系；
　　5. CSMD1的siRNA沉默效率達(dá)到70％左右，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSMD1低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSMD1低表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲；與非腫瘤肝組織相比，臨床HCC中CSMD1呈低表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.與非腫瘤肝組織相比，miR-10b在HCC中的表達(dá)顯著上調(diào)，且miR-10b上調(diào)的水平與患者年齡及HBV感染呈正相關(guān)，提示miR-10

12、b可能與HCC發(fā)生有相關(guān)；
　　2.miR-10b促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并抑制肝癌細(xì)胞凋亡，且miR-10b在體內(nèi)環(huán)境又促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，提示miR-10b在HCC發(fā)生中可能具有癌基因的功能；
　　3.miR-10b與HCC發(fā)生相關(guān)作用機(jī)制可能與miR-10b負(fù)向調(diào)控CSMD1基因表達(dá)有關(guān)，CSMD1在HCC中具有抑癌基因的功能；
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-10b與HCC發(fā)生相關(guān)，其作用機(jī)制可能與miR-