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文檔簡介
1、目的:
本課題旨在研究和探討miR-195是否對PHF19有調控作用,闡述miR-195對HCC發(fā)生發(fā)展過程中分子生物學機制的影響,主要從細胞分子水平和動物整體水平觀察PHF19及調控其表達的miRNA對HCC的影響并探討其相關的機制,為尋找HCC新的治療靶點提供重要依據(jù)。
方法:
一、觀察HCC組織中PHF19的表達情況
1.首先收集30例臨床HCC癌癥組織和配對癌旁組織標本,選取癌旁組織為對照
2、組,癌組織為實驗組。對組織進行RNA提取,通過實時熒光定量PCR分別檢測30例人HCC癌組織和配對癌旁組織中PHF19 mRNA水平的表達。
二、觀察PHF19對肝癌細胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
1.通過構建PHF19慢病毒過表達載體,并將載體轉染到肝癌細胞系HepG2細胞中,并利用蛋白印跡實驗(Western blot)對提取的細胞蛋白質進行分析,驗證其慢病毒PHF19載體的轉染效果。
2.觀察的
3、實驗組與對照組的HepG2細胞通過Transwell膜的數(shù)量,觀察PHF19對肝癌細胞侵襲及遷移能力的影響。
3.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-PHF19 HepG2細胞和LV-Mock HepG2細胞,檢測二者的細胞增殖效果的差異,觀察PHF19對HepG2細胞增殖效率的影響。
4.對培養(yǎng)的LV-PHF19 HepG2細胞和LV-Mock HepG2細胞進行收集,固定,染色后在流式細胞儀上進行檢測,觀
4、察PHF19對細胞周期和凋亡的調控作用。
三、觀察內源性miRNA miR-195-5p對PHF19的調控作用
1.通過生物信息學網站(TargetScan,miRanda,RNA22,miRDB,miR-Gen,PITA,EMBL-EBI,starBase,PicTar,RNAhybrid and miRBase)分析與PHF19特定序列靶向結合的miRNAs,并通過熒光素酶報告試驗驗證結合位點。
2.在
5、HepG2細胞中轉染miR-195-5p mimic,通過蛋白印跡實驗(Western blot)檢測PHF19蛋白水平表達情況。
3.通過收集30例臨床HCC病人癌組織和配對癌旁組織標本,利用RT-RCR檢測組織中miR-195-5p表達情況。
四、觀察miR-195-5p對肝癌細胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
1.通過構建miR-195-5p慢病毒過表達載體,并將載體轉染到肝癌細胞系HepG2細胞中
6、。用Transwell小室觀察過表達miR-195-5p HepG2的處理組細胞與對照組細胞的侵襲及遷移作用的差異。觀察miR-195-5p對HepG2細胞侵襲性的影響。
2.利用CCK-8試劑處理鋪板于96孔板的LV-miR-195-5p HepG2細胞和LV-Mock HepG2細胞,檢測二者的細胞增殖率的差異,觀察miR-195-5p對HepG2細胞增殖效率的影響。
五、觀察PHF19和miR-195-5p對裸
7、鼠成瘤作用的影響
1.分別將處理組LV-PHF19 HepG2細胞、LV-miR-195-5p細胞HepG2,對照組LV-Mock HepG2細胞配置成細胞懸液,注射到裸鼠體內,喂養(yǎng)并每3天稱重,2周后解剖腫瘤組織進行稱重,觀察PHF19及miR-195-5p的對成瘤效果的影響。
結果:
一、觀察HCC癌組織中PHF19的表達情況
1.收集南方醫(yī)院臨床30例肝癌癌癥組織和配對癌旁組織標本,選取癌旁
8、組織為對照組,癌組織為處理組。提取組織RNA,通過RT-PCR分別檢測組織中PHF19的mRNA表達水平。結果顯示,與癌旁組織相比,PHF19在癌組織表達顯著上調(t=-3.909,P=0.001),有統(tǒng)計學意義。
一、觀察PHF19對肝癌細胞系的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
1.本研究通過構建過表達PHF19的慢病毒包裝質粒載體,并將載體轉染到肝癌細胞系HepG2細胞,同時設立實驗組LV-PHF19 HepG2細胞
9、及對照組LV-Mock HepG2細胞,提取轉染PHF19的肝癌細胞株中的總蛋白,并利用蛋白免疫印跡技術(Western blot)對提取的細胞蛋白質進行轉染效果驗證,結果顯不:PHF19過表達的肝癌細胞組轉染效果顯著高于對照組,組間對比有顯著性差異(F=50.43,P<0.001),有統(tǒng)計學意義。
2.利用經典的Transwell小室實驗,觀察穩(wěn)定過表達PHF19的肝癌細胞株侵襲性是否受到增強。結果顯示,與陰性對照組比較,穩(wěn)
10、定過表達PHF19后肝癌細胞的侵襲和轉移能力都顯著增強,組間比較具有統(tǒng)計學意義(invasion:t=-8.736,P<0.001; migration: t=-20.476,P<0.001)。
3.通過CCK-8增殖實驗,我們發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,過表達PHF19可提高肝癌細胞的增殖能力,24小時(F=13.958,P=0.001)和48小時(F=20.582,P<0.001)細胞增殖能力都顯著增高,有統(tǒng)計學意義。
11、 4.通過流式細胞術檢測PHF19過表達后對肝癌細胞周期和凋亡的影響。結果顯示,與LV-Mock HepG2細胞相比,LV-PHF19 HepG2細胞處于G1期細胞數(shù)目減少(F=263.311,P<0.001),有統(tǒng)計學意義;處于S期細胞數(shù)目增多(F=249.19,P<0.001),有統(tǒng)計學意義;而G2M期無顯著性差異(F=0.175,P=0.679),沒有統(tǒng)計學意義。同時凋亡檢測結果顯示:與LV-MockHepG2細胞相比,LV-P
12、HF19 HepG2細胞的細胞凋亡比率明顯減少(t=-11.724,P<0.001),有統(tǒng)計學意義。表明PHF19在HCC病理過程中具有重要作用。
三、觀察調控肝癌過程中PHF19的內源性miRNA
1.為進一步研究與PHF19結合的miRNA,我們通過生物信息學網站(TargetScan,miRanda,RNA22,miRDB,miR-Gen,PITA,EMBL-EBI,starBase,PicTar,RNAhyb
13、rid and miRBase)分析與PHF19靶向結合的miRNAs,并通過熒光素酶報告實驗驗證結合位點,結果顯示PHF19的3'UTR與miR-195-5p區(qū)存在互補配對序列。
2.在HepG2細胞中轉染has-miR-195-5p mimic,通過蛋白印跡實驗(Westernblot)檢測PHF19蛋白水平表達情況。結果顯示,與對照組相比,has-miR-195-5p可明顯下調PHF19的蛋白水平表達,兩組有統(tǒng)計學差異(
14、F=32.033,P<0.001)。
3.對所收集臨床30例HCC病人癌組織和配對癌旁組織標本,提取其RNA,利用RT-RCR檢測miR-195-5p基因水平表達情況,結果顯示癌組織中miR-195-5p表達顯著低于對照組(t=6.67,P=0.001),有統(tǒng)計學意義。驗證了miR-195-5p與PHF19表達呈相反變化趨勢。
四、觀察miR-195-5p對肝癌細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響
1.構建m
15、iR-195-5p慢病毒過表達載體,并將載體轉染到肝癌細胞HepG2中。通過Transwell實驗,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,過表達miR-195-5p可顯著抑制肝癌細胞的體外侵襲(t=11.490,P<0.001)和轉移能力(t=11.355,P<0.001),有統(tǒng)計學意義。
2.增殖實驗結果顯示,相對于對照組,過表達miR-195-5p后24小時HepG2細胞的增殖活力(F=13.489,P=0.001)和48小時(F=16.98
16、8,P=0.000)細胞增殖能力均有顯著下降,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
五、觀察PHF19和miR-195-5p對裸鼠成瘤作用的影響
1.與體外細胞實驗結果相一致,體內動物實驗結果表明,注射表達慢病毒空載載體肝癌細胞的對照組中裸鼠體內瘤塊并未明顯變化,而注射PHF19過表達的肝癌細胞成瘤作用顯著高于對照組(t=6.14,P<0.001),注射miR-195-5p過表達組肝癌細胞則成瘤作用顯著低于對照組(t=-4
17、.552,P<0.001),均有統(tǒng)計學意義。以上結果表明:PHF19具有成瘤作用,而miR-195-5p具有抑瘤作用。
結論:
1.PHF19在肝癌組織中表達明顯高于配對癌旁組織,與肝癌發(fā)展相關。
2.過表達PHF19可明顯促進肝癌細胞的增殖、遷移和生長,并抑制細胞凋亡;3.miR-195-5p通過靶向調控PHF19的轉錄,并下調PHF19的表達;
4.miR-195-5p在肝癌組織中表達明顯低于
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