循環(huán)miR-429在肝細(xì)胞性肝癌早期預(yù)警及診斷中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、一、循環(huán)miR-429在肝細(xì)胞性肝癌早期預(yù)警及診斷中的作用和機(jī)制研究
　　 (一)研究背景和目的：
　　 肝細(xì)胞性肝癌(HCC)是肝臟最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第三位。由于利用現(xiàn)有的肝癌診斷方法大多數(shù)肝癌患者被確診時(shí)已為晚期，導(dǎo)致其5年生存率低至10％-15％，所以對(duì)癌癥發(fā)生的早期預(yù)測(cè)和早期檢測(cè)對(duì)于選擇有效的治療方法來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。目前使用得最廣泛的肝癌篩檢方法包括血清甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)和B超等影像學(xué)

2、檢查等。然而，這些傳統(tǒng)的方法都不能用作肝癌早期預(yù)測(cè)的理想指標(biāo)。相當(dāng)多的肝細(xì)胞性肝癌病人表現(xiàn)出甲胎蛋白水平低或正常，與之相反，約20％-25％的慢性肝炎、肝硬化及其他肝臟疾病患者具有較高AFP水平。另一方面，雖然改進(jìn)的成像技術(shù)使人們有可能發(fā)現(xiàn)肝臟局灶性小病變，但是還很難區(qū)分良性病變與腫瘤，并且診斷結(jié)果與技術(shù)操作人員的經(jīng)驗(yàn)密切相關(guān)，受主觀因素影響較大。由于血清甲胎蛋白和影響學(xué)檢查都不是理想的肝癌預(yù)測(cè)及檢查方法，也就促使我們?nèi)グl(fā)現(xiàn)更加敏感和特

3、異的標(biāo)志物，以期利用這些可能的方法與傳統(tǒng)的檢查方法一起對(duì)腫瘤高危人群發(fā)生HCC的可能性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
　　 miRNAs是一種內(nèi)源性的、長(zhǎng)約22nt的RNA，它通過(guò)靶向mRNA導(dǎo)致其降解或翻譯抑制而在動(dòng)、植物中起到重要的調(diào)節(jié)作用。miRNAs廣泛存在于靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蠅類(lèi)、蠕蟲(chóng)類(lèi)、植物、病毒中，從2002年有統(tǒng)計(jì)的200多種到2008年底的將近9000種，miRNAs的發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)爆發(fā)性增長(zhǎng)，并且不斷有新物種中的miRNAs

4、被發(fā)現(xiàn)。人類(lèi)miRNAs基因僅約占基因總數(shù)的2％-3％，但卻能調(diào)控人體內(nèi)1/3的蛋白表達(dá)，這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用直接影響了這些靶基因的功能，參與了包括消化系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)的生理、病理過(guò)程。miRNAs在消化系統(tǒng)中的作用涉及發(fā)育、老化、分泌、代謝、病毒感染、免疫反應(yīng)、腫瘤等等方面，尤其是作為癌基因或者抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用顯的尤為重要。有研究表明，不同類(lèi)型的消化系統(tǒng)腫瘤有特定的miRNAs異常表達(dá)，和mRNA表達(dá)譜的零散不同，miR

5、NAs在特定腫瘤中聚集成簇表達(dá)，如miR-192、miR-194、miR-215在腸源性腫瘤中成簇高表達(dá)，因此miRNAs可以作為癌癥診斷的工具。很多不同的研究還表明，miRNAs的表達(dá)在肝細(xì)胞性肝癌中是異常失調(diào)的，并且和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、遷移或侵襲有關(guān)，這也就提示我們miRNAs也許能夠作為肝癌診斷的一種新的方法。最新的一些研究表明，循環(huán)miRNAs可以作為理想的血源性新型生物標(biāo)志物用于腫瘤的早期檢測(cè)。此外，血清miRNAs的定量

6、被認(rèn)為可以有力地反映早期腫瘤狀況或者極低腫瘤負(fù)荷情況?；谝陨戏治觯h(huán)miRNAs被用來(lái)作為非侵入性地監(jiān)督肝癌高?；颊叩男碌姆肿訕?biāo)記具有理論可行性。
　　 本研究主要的研究對(duì)象為包含3070個(gè)慢性HBsAg-陽(yáng)性病人的每年進(jìn)行體檢的隊(duì)列，我們首先收集了其中發(fā)生肝癌的患者確診半年至一年以前的血清，通過(guò)篩選出與未發(fā)生肝癌者相比差異表達(dá)的miRNAs譜，以期得到能夠預(yù)測(cè)病毒性肝炎患者發(fā)生肝癌的可能性的循環(huán)miRNAs指紋圖譜，并進(jìn)一

7、步探討這些循環(huán)miRNAs的來(lái)源、作用方式以及調(diào)控機(jī)制。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.利用低密度芯片篩選在影象學(xué)診斷肝癌前約6-12個(gè)月的循環(huán)小RNA特征。
　　 2.利用Taqman探針對(duì)篩選出來(lái)的循環(huán)miRNAs進(jìn)行大樣本單獨(dú)驗(yàn)證。
　　 3.通過(guò)ROC曲線評(píng)價(jià)篩選出來(lái)的循環(huán)miRNAs對(duì)于預(yù)測(cè)肝癌的特異性、敏感性；通過(guò)Logistic回歸的方法判斷篩選出來(lái)的循環(huán)miRNAs是否肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因

8、素，并與AFP進(jìn)行比較。
　　 4.通過(guò)Logistic回歸方程得到的Cutoff值建立肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)，并對(duì)該指標(biāo)的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 5.利用Taqman探針對(duì)肝癌細(xì)胞系內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的相應(yīng)miRNAs進(jìn)行定量，以探討篩選出的循環(huán)miRNAs是否腫瘤來(lái)源。
　　 6.通過(guò)磁珠分選出EpCAM+及CD133+的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)對(duì)其相應(yīng)miRNAs的表達(dá)檢測(cè)，分析其是否腫瘤起始細(xì)胞來(lái)源。
　　 7

9、.通過(guò)相應(yīng)miRNAs的過(guò)表達(dá)以及干擾，驗(yàn)證其對(duì)于腫瘤起始細(xì)胞特性的影響。
　　 8.利用AffymetrixHumanU133plus2.0基因芯片，篩選出相應(yīng)miRNAs的靶基因，通過(guò)構(gòu)建該基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，探討該基因的功能。
　　 9.通過(guò)NOD-SCID老鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)水平驗(yàn)證相應(yīng)miRNAs及其靶基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 10.通過(guò)DNA甲基化分析，探討相應(yīng)miRNAs的異常表達(dá)是否和D

10、NA甲基化有關(guān)。
　　 (三)結(jié)果：
　　 1.循環(huán)miR-429和miR-193a-3p在影像學(xué)及AFP診斷HCC之前即表達(dá)異常，提示其可以作為監(jiān)測(cè)HBsAg-陽(yáng)性病人發(fā)生HCC風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。
　　 2.循環(huán)miR-429和miR-193a-3p在BCLC0期的HCC患者血漿中表達(dá)異常，提示其可以作為HCC極早期診斷的標(biāo)志物。
　　 3.循環(huán)miR-429和miR-193a-3p是HCC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

11、，其特異性、敏感性均優(yōu)于傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)AFP。
　　 4.miR-429在肝腫瘤起始細(xì)胞中高表達(dá)，提示循環(huán)miR-429可能來(lái)源于肝T-ICs，并且，miR-429能夠促進(jìn)肝T-ICs的自我更新、增殖和化療抵抗。
　　 5.miR-429直接靶向抑癌基因RBBP4而調(diào)節(jié)T-ICs的特征，細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)RBBP4能夠逆轉(zhuǎn)miR-429的作用。
　　 6.miR-429通過(guò)直接靶向RBBP4而在體內(nèi)水平促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、

12、生長(zhǎng)。DEN誘導(dǎo)的肝癌模型中也發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-429水平的逐步升高。
　　 7.miR-200b/200a/429簇上游的CpG島低甲基化狀況是導(dǎo)致肝T-ICs中miR-429高表達(dá)的原因。
　　 (四)結(jié)論：
　　 通過(guò)隊(duì)列篩查，本研究首次發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-429和miR-193a-3p可以作為監(jiān)測(cè)HBsAg-陽(yáng)性病人發(fā)生HCC風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。肝腫瘤起始細(xì)胞(T-ICs)來(lái)源的miR-429能夠在體內(nèi)和體外水平通過(guò)直

13、接靶向抑癌基因RBBP4而促進(jìn)肝T-ICs的自我更新、增殖和化療抵抗，并且，我們證實(shí)在1p36區(qū)域miR-200b/200a/429小RNA簇上游CpG島低甲基化狀況是導(dǎo)致肝T-ICs中miR-429高表達(dá)的原因。我們的研究結(jié)果提示miR-429是預(yù)測(cè)HCC發(fā)生新的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。
　　 二、核因子HMGB1介導(dǎo)非酒精性脂肪肝早期階段肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化
　　 (一)研究背景和目的
　　 非酒

14、精性脂肪肝(NAFLD)日益成為全世界發(fā)病最為廣泛的慢性肝病之一，在發(fā)達(dá)國(guó)家更是居于各類(lèi)肝臟疾病之首。雖然，人們對(duì)于非酒精性脂肪肝的研究已逾數(shù)十年之久，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。在眾多相關(guān)研究和假說(shuō)中，Day和James1998年提出的“二次打擊學(xué)說(shuō)”是最為公認(rèn)的理論。另外，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和相關(guān)炎癥信號(hào)通路也在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的協(xié)同作用。胰島素抵抗加速了脂肪的新生和游離脂肪酸的釋放，被肝細(xì)胞吸收后的脂類(lèi)物質(zhì)使得

15、溶酶體通透性增強(qiáng)進(jìn)而促進(jìn)了各種促炎因子的表達(dá)，加之細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和腸源性?xún)?nèi)毒素的釋放致使枯否細(xì)胞過(guò)度激活從而加速了肝臟炎癥和肝細(xì)胞的損傷，并最終激活肝臟星形細(xì)胞導(dǎo)致肝纖維化。盡管很多研究已經(jīng)證明肝臟細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的脂肪、星形細(xì)胞和枯否細(xì)胞參與了非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，但對(duì)于肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞在這其中發(fā)揮的作用卻知之甚少。目前，有關(guān)NAFLD早期發(fā)生的分子機(jī)制還不明確，因此缺少能夠應(yīng)用于臨床實(shí)踐、實(shí)現(xiàn)早期預(yù)防的有效分子標(biāo)志物，較早期的臨床診

16、斷仍然是治療非酒精性脂肪肝的主要途徑。
　　 Toll樣受體(TLRs)是一類(lèi)主要識(shí)別外源病原信號(hào)分子(PAMPs)和內(nèi)源損傷分子(DAMPs)的跨膜受體。廣為人知的核內(nèi)因子高遷移率組蛋白HMGB1就是能與其結(jié)合的一種DAMPs。Toll樣受體與配體結(jié)合后，能夠激活天然免疫應(yīng)答系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，在宿主防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種Toll受體，其中TLR4受體是首個(gè)被報(bào)道并且研

17、究最為深入的明星分子。越來(lái)越多的證據(jù)表明TLR4還參與了肝損傷的病理進(jìn)程，如肝纖維化，肝臟缺血再灌注，酒精誘導(dǎo)的肝損傷，MCDD(甲硫氨酸和膽堿缺乏性飲食)和果糖誘導(dǎo)的NAFLD。另外有研究報(bào)道高脂飲食(HFD)引起的細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的游離脂肪酸(FFA)能夠活化TLR4信號(hào)通路，促進(jìn)2型糖尿病胰島素耐受。但FFA到底通過(guò)什么分子介導(dǎo)了TLR4信號(hào)通路而促進(jìn)HFD誘導(dǎo)的NAFLD，尤其是早期發(fā)生時(shí)TLR4通路發(fā)揮的功能和分子機(jī)制至今仍然不甚清

18、楚。
　　 本研究旨在建立高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝模型，通過(guò)對(duì)其早期階段進(jìn)行研究，探討肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的TLR4信號(hào)在NAFLD早期階段的作用，并進(jìn)一步研究活化NAFLD早期階段TLR4信號(hào)的配體，以期為NAFLD的早期干預(yù)、病情轉(zhuǎn)歸提供新的思路。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.利用HFD喂養(yǎng)TLR4-wildtype(C57BL/10SNJ)，TLR4-knockout(C57BL/10Sc

19、NJ)，MyD88-knockout，TRIF-knockout和TLR2-knockout的老鼠4周-12周，觀察NAFLD早期階段表現(xiàn)。
　　 2.采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)NAFLD鼠肝TNF-α，IL-6，MCP-1以及MIP-2的表達(dá)改變。
　　 3.HE染色觀察NAFLD鼠肝大體形態(tài)改變，免疫組化方法檢測(cè)NAFLD鼠肝巨噬細(xì)胞積聚、P65入核、HMGB1釋放等。
　　 4.建立骨髓移植小鼠模型，觀察骨

20、髓來(lái)源非實(shí)質(zhì)細(xì)胞在NAFLD早期階段的作用。
　　 5.利用GadoliniumChloride(GdCl3)清除肝臟Kupffer細(xì)胞，觀察Kupffer細(xì)胞清除對(duì)NAFLD早期階段的影響。
　　 6.利用鱟試劑盒檢測(cè)門(mén)靜脈血中LPS的水平，利用WESTERNBLOT技術(shù)檢測(cè)血漿中HMGB1的水平。
　　 7.利用封閉抗體封閉HMGB1的作用，觀察HMGB1封閉對(duì)NAFLD炎癥反應(yīng)的影響。
　　 8.利

21、用干擾小RNA降低TLR4的表達(dá)，觀察TLR4表達(dá)改變對(duì)NAFLD炎癥反應(yīng)的影響。
　　 (三)結(jié)果：
　　 1.在NAFLD早期階段，TLR4敲除能夠緩解HFD造成的肝臟失功能和炎癥反應(yīng)。
　　 2.TLR4信號(hào)參與了NAFLD早期階段肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化。
　　 3.Kupffer細(xì)胞和骨髓來(lái)源的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的TLR4信號(hào)不是NAFLD早期階段必須的。
　　 4.HFD能夠誘導(dǎo)TLR4內(nèi)源

22、性配體HMGB1從TLR4野生型的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中釋放。
　　 5.HMGB1在體外水平介導(dǎo)FFA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，HMGB1的封閉性抗體能夠抑制這種反應(yīng)。
　　 6.TLR4/MyD88依賴(lài)性的信號(hào)通路是HMGB1釋放所必須的。
　　 (四)結(jié)論：
　　 通過(guò)建立HFD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD模型，我們對(duì)NAFLD早期階段的分子及細(xì)胞事件進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)在NAFLD發(fā)生的早期階段，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的TLR4信號(hào)起主