人精漿miR-106b與男性不育的相關(guān)性及機(jī)制研究.pdf

1、目的:在優(yōu)化人精漿miRNAs提純方法的基礎(chǔ)上，研究不同類型男性不育癥患者精漿miR-106b的表達(dá)變化，探索miR-106b作為診斷男性不育分子靶標(biāo)的可能性;并且以不同發(fā)育時(shí)期的小鼠睪丸，小鼠精原細(xì)胞（GC-1）和精母細(xì)胞（GC-2）細(xì)胞系為材料，研究miR-106b對(duì)生精細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:1.優(yōu)化及驗(yàn)證人精漿miRNAs提純方法:收集國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科研所生殖健康服務(wù)中心就診者精液樣本。根據(jù)不同RNA提取方

2、法分為4組:Trizol LS組、蛋白酶K+Trizol LS組、miRNeasy Micro kit組及Trizol LS+miRNeasy Micro kit聯(lián)合使用組（改良組）。比較4組提純精漿RNA的OD260/280，使用Agilent2100生物分析儀檢測(cè)改良法提純精漿miRNA的純度和質(zhì)量，比較4組Real-time PCR檢測(cè)精漿miR-106b和miR-9表達(dá)豐度的溶解曲線。2.miR-106b在男性不育癥患者精漿中的

3、表達(dá)變化:收集國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科研所生殖健康服務(wù)中心的正常精漿樣本（精液常規(guī)檢查參數(shù)正常且一年內(nèi)配偶懷孕并正常分娩）15例，非梗阻性無(wú)精子癥精漿樣本（臨床確診）30例，弱精子癥精漿樣本（臨床確診）10例。Real-time PCR檢測(cè)正常組(n=5)、非梗阻性無(wú)精子癥組(n=10)miR-106b的表達(dá)量，結(jié)果顯示有顯著差異，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，正常組(n=10)、非梗阻性無(wú)精子癥組(n=20)并添加弱精子癥組(n=10)檢測(cè)miR-106

4、b的表達(dá)量。3.miR-106b對(duì)生精細(xì)胞功能的影響及其分子機(jī)制:(1)Real-time PCR檢測(cè)miR-106b在不同發(fā)育時(shí)期(7d，14d，21d，35d，64d)小鼠睪丸組織中表達(dá)水平。(2)慢病毒包裝miR-106b mimics（模擬物），miR-106b inhibitor（抑制物），miR-106b mimics control（模擬物對(duì)照）和miR-106b inhibitor control（抑制物對(duì)照），感染GC

5、-1、GC-2，通過(guò)共聚焦顯微鏡和Real-time PCR檢測(cè)及鑒定穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。MTS法檢測(cè)感染慢病毒后GC-1、GC-2的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-106b對(duì)GC-1、GC-2凋亡及細(xì)胞周期的影響。(3)通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)miR-106b可能的靶基因，篩選與生精細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因，Real-time PCR檢測(cè)其在上述慢病毒感染的各細(xì)胞株中的表達(dá)變化，比較其與miR-106b的表達(dá)趨勢(shì)，初步判斷其為miR-1

6、06b靶基因的可能性。
　　結(jié)果:1.(1)改良組提純的精漿RNA OD260/280為(1.90±0.03)顯著高于其它三組(p＜0.05)。(2)改良組提純的miRNA通過(guò)Agilent2100生物分析系統(tǒng)檢測(cè)，色譜圖位置特異性明顯，峰值清晰，質(zhì)量合格，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。(3)Real-time PCR檢測(cè)miR-106b顯示，以前三組為模板的溶解峰不單一，非特異性擴(kuò)增明顯，改良組的溶解曲線標(biāo)準(zhǔn)，峰型窄而尖。Real-ti

7、me PCR檢測(cè)miR-9顯示，前兩組方法峰型不單一，具有非特異性擴(kuò)增，第三組雖具有單一峰型，但上升曲線相較于改良組，不夠平滑。2.小樣本Real-time PCR檢測(cè)miR-106b在精液參數(shù)正常精漿樣本和非梗阻性無(wú)精子癥患者精漿中的表達(dá)豐度，結(jié)果顯示miR-106b在非梗阻性無(wú)精子癥患者精漿樣本中表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照(P＜0.01)，擴(kuò)大樣本量檢測(cè)精液參數(shù)正常精漿樣本(n=10)、非梗阻性無(wú)精子癥精漿樣本(n=20)和弱精子癥精漿

8、樣本(n=10)中miR-106b的表達(dá)豐度，結(jié)果顯示miR-106b在非梗阻性無(wú)精子癥組及弱精子癥組的表達(dá)量均顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)，在弱精子癥樣本中的表達(dá)量顯著高于非梗阻性無(wú)精子癥(P＜0.05)。3.(1)Real-time PCR檢測(cè)miR-106b在不同發(fā)育時(shí)期小鼠睪丸組織中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)第7天時(shí)miR-106b的表達(dá)量最高，從7～35天，miR-106b的表達(dá)量隨著小鼠睪丸的發(fā)育呈逐漸降低的趨勢(shì)(P＜0.01)，

9、35天與64天相比，小鼠睪丸組織中miR-106b的表達(dá)量無(wú)顯著變化。(2)慢病毒感染GC-1、GC-2后，共聚焦顯微鏡下觀察到綠色熒光亮度很強(qiáng)，感染率高達(dá)85％。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示慢病毒感染后GC-1、GC-2中miR-106b mimics組與miR-106b mimics control組相比，表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)，miR-106b inhibitor組與miR-106b inhibitor cont

10、rol組相比，表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)。(3)在GC-1、GC-2中，miR-106bmimic組與其對(duì)照組相比細(xì)胞增殖能力有所增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而miR-106b inhibitor組的趨勢(shì)正好和miR-106b mimics組相反，抑制miR-106b表達(dá)后，GC-1、GC-2的細(xì)胞增殖能力均有所減弱(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明miR-106b具有促進(jìn)生精細(xì)胞增殖的作用。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢

11、測(cè)結(jié)果顯示:在GC-1、GC-2中，miR-106b mimics組與其對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著降低，miR-106b inhibitor與其對(duì)照相比，細(xì)胞凋亡率顯著升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明miR-106b具有抑制生精細(xì)胞凋亡的作用;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，慢病毒感染GC-1、GC-2后，miR-106b mimics組比miR-106b inhibitor組在G0/G1期細(xì)胞百分比顯著降低、S期細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05）。

12、(5)靶基因預(yù)測(cè)及Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GC-1、GC-2中，STAT3在miR-106b mimics組中的表達(dá)量顯著低于其對(duì)照組(P＜0.01)，miR-106b inhibitor組與其對(duì)照相比，STAT3的表達(dá)量在GC-1中差異不顯著，在GC-2中，STAT3在miR-106b inhibitor組中的表達(dá)量顯著高于其對(duì)照組(P＜0.01);在GC-1和GC-2中，SOCS3在miR-106b mimics組中

13、的表達(dá)量均顯著低于其對(duì)照組(P＜0.05)，而miR-106b inhibitor組與其對(duì)照相比，SOCS3的表達(dá)量在GC-1中差異不明顯，在GC-2中，SOCS3在miR-106b inhibitor組中的表達(dá)量顯著高于其對(duì)照組(P＜0.05);在GC-1中，miR-106b mimics組與其對(duì)照組相比，SMAD5的表達(dá)量具有下降趨勢(shì)，miR-106b inhibitor組與其對(duì)照組相比，SMAD5的表達(dá)量有所升高，但是差異不顯著(

14、P＞0.05)，而在GC-2中，miR-106bmimics組與其對(duì)照組相比SMAD5的表達(dá)量上升，而在miR-106b inhibitor組及其對(duì)照組中SMAD5的表達(dá)量均低于miR-106b mimics組及其對(duì)照組，差異不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.Trizol LS+miRNeasy Micro kit聯(lián)合使用法（改良法）提純的精漿miRNA質(zhì)量好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。2.miR-106b在非梗阻性無(wú)精子癥及弱

15、精子癥患者精漿中表達(dá)豐度顯著低于正常對(duì)照組;弱精子癥組中miR-106b的表達(dá)量顯著高于非梗阻性無(wú)精子癥組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.從出生后7天到35天的小鼠睪丸中，miR-106b的表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì)，35天后表達(dá)量趨于平穩(wěn)。miR-106b能夠促進(jìn)GC-1、GC-2細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，具有促進(jìn)其細(xì)胞周期由G1期向S期過(guò)渡的趨勢(shì)，抑制miR-106b的表達(dá)會(huì)引起GC-1、GC-2細(xì)胞周期阻滯在G1期。預(yù)測(cè)的靶基因STAT3、SO