利用秀麗隱桿線蟲表達(dá)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11蛋白的轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是牛、羊等反芻動(dòng)物的主要寄生性線蟲,寄生于動(dòng)物皺胃粘膜的表面,引起捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病,導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)貧血、消瘦,甚至引起死亡。使用抗蠕蟲藥物是目前防治該病的主要措施,但線蟲耐藥性的日益嚴(yán)重迫切需要發(fā)展新的防治策略,疫苗作為一種新的有效的防治策略,具有廣闊的應(yīng)用前景。由于線蟲具有復(fù)雜的生活史,抗原成分繁多,到現(xiàn)在為止,還沒有一種線蟲疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)。氨肽酶H11是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L4幼蟲和成蟲階

2、段表達(dá)的一種整合膜蛋白,被認(rèn)為是目前為止免疫效果最好的一種候選抗原(減卵率＞90％,減蟲率＞75％),而利用大腸桿菌和昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組形式均不能引起有效的免疫保護(hù)。秀麗隱桿線蟲因其與寄生性線蟲在進(jìn)化上的近緣性,被認(rèn)為是研究寄生性線蟲基因功能和表達(dá)寄生性線蟲疫苗候選抗原的理想系統(tǒng)。本研究的主要目的是:探明捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗候選抗原基因H11的基因組結(jié)構(gòu)特征；同時(shí)以秀麗隱桿線蟲為模式,建立研究寄生性線蟲基因功能和表達(dá)寄生性線蟲疫苗候

3、選抗原的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系；在此基礎(chǔ)上分析H11基因5’側(cè)翼區(qū)序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,研究利用建立的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,表達(dá)H11基因的可行性,為寄生性線蟲的疫苗研制提供新方法。1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗候選抗原基因H11的基因組結(jié)構(gòu)分析
　　 參照已發(fā)表的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲疫苗候選抗原H11的基因序列,以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ZJ株的總RNA為模板,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,成功擴(kuò)增出H11基因。對(duì)H11及其同源類似物進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)H11含有一個(gè)鋅指結(jié)合基序

4、HEXXHXW,具有典型的微粒體氨肽酶結(jié)構(gòu)域特征。通過在功能域保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物,利用長(zhǎng)距離PCR技術(shù)和基因步移技術(shù),成功獲得了H11的基因組序列。結(jié)果表明,H11的ORF大小為2919 bp,編碼972個(gè)氨基酸；獲得的H11基因組大小為14959 bp,擁有25個(gè)外顯子和24個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子和外顯子之間具有典型的GT……AG結(jié)構(gòu)。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲H11基因組序列的獲得為我們進(jìn)一步開展H11的相關(guān)研究提供了重要素材。2.以秀麗隱桿線蟲為

5、模式,建立研究寄生性線蟲基因功能和表達(dá)寄生性線蟲疫苗候選抗原的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系
　　 為建立秀麗隱桿線蟲的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,利用PCR技術(shù)從秀麗隱桿線蟲基因組DNA中擴(kuò)增獲得Act-1基因的核心啟動(dòng)子序列、T07F10.1A基因的核心啟動(dòng)子序列與3’UTR的Poly(A)信號(hào)序列,以及從表達(dá)載體pEGFP-N1上擴(kuò)增獲得SV40早期mRNA的Poly(A)信號(hào)序列與EGFP基因。以pBluescript SK+或pEGFP-4.1為

6、基本載體骨架,分別構(gòu)建由Act-1基因的核心啟動(dòng)子序列、T07F10.1A基因的核心啟動(dòng)子序列調(diào)控,EGFP作為報(bào)告基因的重組表達(dá)載體。通過顯微注射將重組載體與Marker質(zhì)粒pRF4共注射到秀麗隱桿線蟲性腺,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組載體Pact-EGFP中Act-1基因的核心啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)EGFP在秀麗隱桿線蟲的皮層、副皮層以及咽部表達(dá)。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)重組載體Pact-EGFP和pB-Pact-EGFP-SV40T中的核心啟

7、動(dòng)子能夠指導(dǎo)EGFP在Vero細(xì)胞中表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度具有較大的差異,表明秀麗隱桿線蟲Act-1基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域上游以及基因下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)域可能存在與轉(zhuǎn)錄水平密切相關(guān)的獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。該研究為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)寄生性線蟲基因在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。3.利用建立的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,分析H11基因5’側(cè)翼區(qū)序列的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性
　　 為進(jìn)一步分析H11基因的5’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性,在獲得的H11基因組序列的基礎(chǔ)上,再次利

8、用基因步移技術(shù)擴(kuò)增5’上游的部分基因組序列,確認(rèn)H11基因5,側(cè)翼區(qū)大小為1517 bp；同時(shí)獲得了H11亞型H11-4最后一個(gè)外顯子和3’UTR序列,發(fā)現(xiàn)H11-4基因與H11基因在染色體上不僅是連鎖的,而且具有相同的基因延伸方向。將獲得的5’側(cè)翼區(qū)序列單獨(dú)或聯(lián)合H11基因的前兩個(gè)外顯子、第一內(nèi)含子以及第二內(nèi)含子的部分序列克隆到表達(dá)載體ppd95.77 GFP基因的上游,顯微注射到線蟲的性腺。結(jié)果表明H11基因5’側(cè)翼區(qū)序列能夠指導(dǎo)G

9、FP在秀麗隱桿線蟲L4幼蟲和成蟲腸管的前端和末端特異性表達(dá),且顯示出與H11在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲體內(nèi)不完全相同的表達(dá)模式；H11的部分外顯子和內(nèi)含子序列在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)正確的剪接,這可能與H11是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲寄生階段特異性表達(dá)的蛋白有關(guān)。4.利用建立的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,篩選用于指導(dǎo)H11疫苗候選抗原表達(dá)的啟動(dòng)子序列,并在該啟動(dòng)子的指導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)H11基因在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的表達(dá)
　　 選擇秀麗隱桿線蟲體內(nèi)H11的同系物T07F10

10、.1a基因以及腸道特異性表達(dá)的cpr-1和elt-2基因的5’側(cè)翼區(qū)序列作為篩選對(duì)象,用以在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)表達(dá)H11疫苗候選抗原。T07F10.1a、cpr-1和elt-2基因的1885 bp、1985 bp和1998 bp的5’側(cè)翼區(qū)序列克隆到表達(dá)載體ppd95.77 GFP基因的上游,顯微注射到線蟲的性腺。結(jié)果顯示,在T07F10.1a基因的5’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄下,GFP能夠在秀麗隱桿線蟲除去胚胎期的整個(gè)生命周期中都有表達(dá),表達(dá)部位主

11、要集中在秀麗隱桿線蟲的尾部神經(jīng)元、咽部、分泌細(xì)胞、腸道細(xì)胞以及神經(jīng)系統(tǒng)；在cpr-1基因的5’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄下,GFP能夠特異性的在線蟲的整個(gè)腸道表達(dá),尤其在L4幼蟲和成蟲階段,GFP呈現(xiàn)較高強(qiáng)度的表達(dá)；在elt-2基因的5’側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄下GFP能夠在L3幼蟲到成蟲階段的腸道表達(dá),且呈現(xiàn)明顯的區(qū)段性,即腸道最前端的腸環(huán)1(int1,前腸)、中腸(腸道最中間的部分)以及腸道末端,尤其int1位置的GFP呈現(xiàn)較高強(qiáng)度的表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度與部位因

12、蟲體個(gè)體不同有較大差異。根據(jù)GFP表達(dá)的組織定位、L4幼蟲和成蟲階段GFP的表達(dá)強(qiáng)度以及蟲體表達(dá)GFP的穩(wěn)定性等差異,最后采用cpr-1的5’側(cè)翼區(qū)序列作為在秀麗隱桿線蟲表達(dá)H11的啟動(dòng)子。
　　 在已獲得的重組載體cpr-15’側(cè)翼區(qū)∷GFP基礎(chǔ)上,利用特異性引物ppdF/ppdR,在高保真酶作用下,通過長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增切除GFP基因,進(jìn)行載體自連、環(huán)化,同時(shí)在載體上引入SacⅠ、SacⅡ等4個(gè)酶切位點(diǎn)構(gòu)建重組表達(dá)載體cpr-

13、pPD95.77(G-)；通過引入EGFP基因?qū)χ亟M載體驗(yàn)證后,利用SacⅠ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶將基因兩端加有6×His標(biāo)簽的H11及其部分基因片段Trans-HSP分別引入重組表達(dá)載體。cpr-pPD95.77(G-)中cpr-15’側(cè)翼區(qū)能夠指導(dǎo)EGFP在秀麗隱桿線蟲的腸道特異性表達(dá)表明改造后的重組載體在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)具有表達(dá)外源基因的功能。Western-blot分析結(jié)果顯示,在cpr-15’側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)下,H11基因在秀麗隱

14、桿線蟲體內(nèi)沒有明顯表達(dá),而Trans-HPS能夠在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)表達(dá)；盡管His單克隆抗體與多克隆抗體能夠檢測(cè)到大小一致的特異性目的條帶,利用鎳瓊脂糖凝膠的方法卻未能實(shí)現(xiàn)對(duì)Trans-HPS的純化,因此,我們選擇Trans-HPS轉(zhuǎn)基因線蟲的全蟲抗原作為免疫原進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn)。5.利用獲得的轉(zhuǎn)基因蛋白免疫山羊,比較分析免疫保護(hù)效果
　　 采用液體培養(yǎng)的方法大量獲取轉(zhuǎn)基因表達(dá)Trans-HPS蛋白的秀麗隱桿線蟲成蟲,制各全

15、蟲抗原,以250μg/只的劑量免疫山羊,加強(qiáng)免疫一次,用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲L3幼蟲5000條/只的感染強(qiáng)度感染山羊,結(jié)合各種指標(biāo)檢測(cè)含有Trans-HPS蛋白的全蟲抗原的免疫保護(hù)效果。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明首免后兩周既可檢測(cè)到較高的IgG抗體水平,二免后兩周達(dá)到高峰,二免后7周抗體水平仍可維持較高水平；外周血淋巴增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示,Trans-HSP蛋白能夠顯著增強(qiáng)Trans-HPS蛋白免疫組(p＜0.01)和HPS蛋白免疫組(p＜0.05)淋

16、巴細(xì)胞的增殖活性；對(duì)不同免疫組山羊排出蟲卵數(shù)、幼蟲孵化率和成蟲數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)Trans-HPS蛋白免疫組減卵率為41.4％,且能明顯延緩排卵高峰期的到來；Trans-HPS蛋白免疫組成蟲減少率為17.79％,與感染陽性組比較差異不顯著。
　　 綜上,本研究首次獲得了H11的基因組序列,發(fā)現(xiàn)了亞型H11-4與H11之間的基因連鎖現(xiàn)象；建立了以秀麗隱桿線蟲為模式的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系,利用該體系成功實(shí)現(xiàn)了H11部分基因片段Trans