秀麗隱桿線蟲-多重耐藥鮑曼不動桿菌感染模型的建立.pdf

1、目的：建立線蟲—多重耐藥鮑曼不動桿菌感染模型，為下一步研究鮑曼不動桿菌致病機制及從整體動物水平觀察藥物抗菌效果奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法：2.1 線蟲同期化處理
　　將孕蟲洗脫至15ml離心管中，洗滌，離心，棄上清液，調(diào)整溶液至3.5ml;加入1.5ml線蟲裂解液進(jìn)行裂解;再用M9buffer洗滌3次。20℃過夜培養(yǎng)，獲得L1期幼蟲。將LI期線蟲轉(zhuǎn)接至新的線蟲培養(yǎng)板，于20℃培養(yǎng)48h至L4期。
　　2.2 感染平板的制

2、備
　　將待測菌稀釋為1.2×109CFU/mL，吸取100μL菌懸液到10cm平板上，用無菌涂布棒將菌液均勻地涂布在NGM平板上，但不要涂到平板邊緣。室溫下干燥20min后，置于37℃培養(yǎng)8h，冷卻至室溫待用。
　　2.3 線蟲固體致死實驗在每塊感染平板上轉(zhuǎn)接10條L4期線蟲，其中為了防止N2線蟲繁殖，在感染平板中滴加一定濃度的FUDR，其中E.coli OP50為實驗對照組，每組均含10塊感染平板。20℃培養(yǎng)每24h觀察

3、一次線蟲的存活，當(dāng)其身體僵直且對觸碰無反應(yīng)則判定為死亡。
　　2.4 線蟲液體致死實驗
　　2.4.1 不同濃度的MRDAB對線蟲的致死實驗
　　將約20-30條L4期線蟲轉(zhuǎn)入96孔板，每孔加入40ul含有一定濃度細(xì)菌的LB溶液、160ul M9緩沖以及0.2mmoml/LFUDR。其中感染組分別加入40ul濃度為1.2×107、1.2×108、1.2×109的MRDAB，陰性對照組加入40ul濃度為1.2×109CF

4、U/mL的E.coli OP50;空白對照組加入20％LB溶液;每種菌液做5個復(fù)孔，20℃靜置培養(yǎng)，每24h觀察一次線蟲的存活。所有組均重復(fù)3次.
　　2.4.2 不同耐藥程度的AB對線蟲的致死實驗
　　選取終濃度1.2×109CFU/ml不同耐藥程度的AB感染線蟲，每孔含有20-30條線蟲轉(zhuǎn)移至96孔板，感染組:分為A、B、C三組，分別加入菌株A（敏感菌株）、菌株B（多重耐藥菌株）、菌株C（泛耐藥菌株）;陰性對照組:E.C

5、oli OP50。每種菌液做5個平行，其中為了防止N2線蟲繁殖，滴加0.2mmol/L的FUDR，在20℃培養(yǎng)指定的時間，每天記錄線蟲的存活數(shù)。所有組均重復(fù)3次。
　　2.5 線蟲腸道內(nèi)細(xì)菌計數(shù)及鑒定
　　選取1.2×109cfu/mL MDRAB對線蟲進(jìn)行感染，挑取10條經(jīng)感染24h的線蟲，用疊氮化鈉液清洗蟲體3次，以抑制線蟲體內(nèi)細(xì)菌外逸，將蟲和200ul的M9緩沖液加入1.5mlEP管中，再加入滅菌后的石英砂劇烈震蕩2-

6、3min，裂解蟲體，釋放細(xì)菌，取上清液進(jìn)行細(xì)菌純培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)菌重新鑒定及藥敏測試。
　　2.6 線蟲抗感染救治方法
　　按2.4步驟將L4期線蟲感染24h后，將感染后的線蟲用用M9buffer反復(fù)洗滌4次后，收集蟲體，取20～30條感染后的線蟲轉(zhuǎn)移至96孔板（每孔加入LB溶液40ul，M9緩沖160ul，0.2mmoml/LFUDR及適量抗生素），每組做5個復(fù)孔，20℃靜置培養(yǎng)。實驗組:加入不同濃度抗生素:美羅培南(0、1

7、6、32、64ug/ml)和替加環(huán)素（0、8、16和32ug/ml);陰性對照組:不加任何抗生素，對線蟲進(jìn)行抗感染治療。第一排為陰性對照，不加任何抗生素，其后各孔加其后各孔加入不同濃度的抗生素，對線蟲進(jìn)行感染治療，每組實驗平行做3組，每24h觀察一次線蟲的存活。
　　2.7 統(tǒng)計分析
　　以上實驗均重復(fù)3次，采用IBM SPSS Statitics20軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。主要采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，log

8、-rank檢驗法對組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析;完全隨機設(shè)計資料采用One-Way ANOVA分析進(jìn)行均數(shù)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：3.1 線蟲固體致死實驗
　　MDR-Ab平板上的線蟲致死現(xiàn)象較OP50板明顯，在感染4～6d開始不斷死亡，而E.coli OP50組的線蟲一般在3周后才出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。但Ab-線蟲固體致死實驗存在以下缺陷，很難收集穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。
　　3.2 液體致死實驗
　　

9、3.2.1 不同濃度的MRDAB對線蟲的致死實驗
　　結(jié)果顯示，1.2×107cfu/mL MDRAB組與E.coliOP50對照組的生存曲線無統(tǒng)計學(xué)差異(x2=0.148，P=0.70)，提示該菌液濃度對線蟲無明顯致死效果;1.2×108、1.2×109cfu/mL MDRAB兩組的生存率都低于E.coliOP50對照組，并且生存曲線與對照組均有統(tǒng)計學(xué)差異(x2分別為38.47、90.18，P值均＜0.001)，說明菌液濃度在1

10、.2×108～1.2×109cfu/mL范圍內(nèi)的MDRAB對線蟲有感染致死效果。將1.2×108、1.2×109cfu/mL MDRAB兩組進(jìn)行組間比較，二者線蟲生存曲線有統(tǒng)計學(xué)差異（x2=21.91，P＜0.001），提示1.2×109cfu/mL MDRAB組對線蟲的致死作用比前者更顯著。
　　3.2.2 不同耐藥程度的AB對線蟲的致死實驗
　　結(jié)果顯示，A、B、C、D線蟲的生存時間均數(shù)分別為9.4、9.7、9.5、15

11、.4天;采用log-rank檢驗進(jìn)行水平兩兩比較顯示，不同耐藥程度的鮑曼不動桿菌對線蟲致死性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但A、B、C三組均與D組的線蟲生存曲線存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。提示敏感、多重耐藥、泛耐藥鮑曼不動桿菌均能縮短線蟲壽命，能對線蟲產(chǎn)生感染致死作用，但是不同耐藥性的鮑曼不動桿菌在線蟲感染模型中無明顯毒力差異。
　　3.3 感染線蟲腸道菌種鑒定及細(xì)菌計數(shù)將感染線蟲裂解液進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏測試，證實為MDRAB

12、。分別將感染MDRAB4h、8h、12h、24h后的線蟲腸道裂解，并將上清液進(jìn)行細(xì)菌平板計數(shù)，線蟲體內(nèi)菌量分別為（0.22±0.02）×105、（0.54±0.03）×105、（1.69±0.02）×105、（3.22±0.60）×105cfu/ml。采用One-WayANOVA分析，不同時間點感染線蟲腸道內(nèi)菌量有統(tǒng)計學(xué)差異(F=27.32，P＜0.001)，說明MDRAB能夠在線蟲體內(nèi)不斷定植和繁殖，造成線蟲感染致死。
　　3.

13、4 抗生素對感染線蟲的救治
　　將不同濃度的美羅培南對感染MDRAB的線蟲進(jìn)行救治時發(fā)現(xiàn)，與未治療組相比，16ug/mL美羅培南幾乎無明顯治療效果(x2=2.093，P=0.148)。32ug/mL、64ug/mL的美羅培南可以提高線蟲的存活率，10d后線蟲存活率分別為51.7％、62.8％，與未治療組相比存活率提高了2～3倍(P＜0.001)。將美羅培南濃度分別為32ug/mL、64ug/mL的兩組進(jìn)行l(wèi)og-rank組間比較，

14、發(fā)現(xiàn)二者線蟲生存曲線存在統(tǒng)計學(xué)差異(x2=7.129，P＜0.05)。說明在32～64ug/mL的藥物濃度范圍內(nèi)，美羅培南對線蟲治療有效，且療效與藥物濃度呈正相關(guān)。將不同濃度的替加環(huán)素對感染MDRAB的線蟲進(jìn)行救治時發(fā)現(xiàn)，隨著替加環(huán)素治療濃度的增加，感染線蟲中位生存時間呈增加趨勢。采用log-rank檢驗顯示，8ug/ml的替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=0.105、1.4，P=0.746）;16ug/

15、ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=81.290，P＜0.001)，32ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=124.302，P＜0.001)。說明在16～32ug/mL的藥物濃度范圍內(nèi)，替加環(huán)素對線蟲治療有效，且療效與藥物濃度呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：4.1 線蟲液體感染法相比于固體感染法，前者更能確保實驗的良好的可操作性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　4.2 M