鈣離子結(jié)合蛋白S100A4的原核表達(dá)純化以及S100A6單克隆抗體的制備.pdf

1、肝臟是人體最大的消化器官,主要負(fù)責(zé)維持新陳代謝的正常進(jìn)行。由于肝臟參與食物消化這一特殊功能,使其極易發(fā)生病變,引起包括急性肝衰和肝臟纖維化等發(fā)病率和死亡率都較高的疾病的發(fā)生,從而引起人們的重視。通過CCl4誘導(dǎo)的小鼠急慢性肝損傷模型和基因芯片等技術(shù)手段,我們深入探討了肝臟損傷修復(fù)的原理和機(jī)制,從而獲得治療肝損傷的全新思路和藥物靶點(diǎn)。其中S100家族隨著肝臟損傷修復(fù)過程呈現(xiàn)的規(guī)律性的表達(dá)變化,使其成為我們的重點(diǎn)研究對(duì)象。
　　本文以

2、S100家族為切入點(diǎn),主要包括兩部分的研究內(nèi)容:重組人S100A4的原核表達(dá)純化及活性測(cè)定和S100A6單克隆抗體的制備。S100A4是S100蛋白家族的成員,在細(xì)胞的增殖,分化,損傷修復(fù)以及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究將S100A4全長基因構(gòu)建到pET28a原核表達(dá)載體上,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化出高純度的重組人S100A4。通過試驗(yàn)證明,重組人S100A4蛋白在體外可以有效的增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞A375-S2的增殖

3、。重組人S100A4原核表達(dá)與純化方法的建立將促進(jìn)其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究,并且對(duì)于S100蛋白家族其他蛋白的表達(dá)與純化具有重要的參考意義。并且可用于后期對(duì)肝臟纖維化模型的藥效和藥理研究。為了制備抗人S100A6的單克隆抗體,利用原核表達(dá)純化后所得純度>97％的hS100A6為抗原,與弗氏佐劑相結(jié)合免疫Balb/c小鼠。利用雜交瘤技術(shù),處死免疫小鼠,取脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞融合,利用HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤。采用Elisa檢

4、測(cè),并用有限稀釋法篩選出分泌特異抗人S100A6抗體的雜交瘤細(xì)胞株。腹腔注射同種小鼠誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生,并應(yīng)用Protein G親和層析法進(jìn)行抗體純化。采用單克隆抗體可變區(qū) VH和VL基因組測(cè)序,為抗體可變區(qū)分區(qū);通過Elisa、Western Blot鑒定該單克隆抗體。結(jié)果獲得2株可穩(wěn)定分泌小鼠抗人 S100A6的單克隆抗體,分別命名為5-1G,8-6G。Elisa和Western Blot分析表明該2株單抗均能特異性識(shí)別 hS100A6。