人源S100A4蛋白的功能表達(dá)及單抗制備.pdf

1、目的:
　　本研究采用全基因合成法，PCR（polymerase chain reaction)合成S100A4基因片段。構(gòu)建表達(dá)人源S100A4蛋白的重組質(zhì)粒，并使之高效表達(dá)，再以純化后獲得的人源S100A4蛋白免疫Balb/c小鼠，從而制備穩(wěn)定分泌抗人S100A4單克隆抗體（mAb）的雜交瘤細(xì)胞系，并對(duì)其分泌的mAb進(jìn)行性質(zhì)鑒定。
　　方法:
　　1.采用全基因合成法，PCR合成S100A4基因片段。并根據(jù)大腸桿菌

2、密碼子偏好性，利用Condonopt密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化從GeneBank中檢索到的人源S100A4基因序列，全部選用偏好密碼子設(shè)計(jì)合成S100A4序列引物。通過(guò)雙酶切、膠回收純化、連接后得到pET32a-S100A4重組載體。
　　2.將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thingalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)后表達(dá)的重組蛋白再經(jīng)離子交換層析純化。<

3、br>　　3.用免疫印跡(Western-blot)法檢測(cè)重組蛋白的抗原活性，腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組蛋白生物活性。
　　4.用純化后獲得的人源S100A4重組蛋白免疫Balb/c小鼠，利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)制備抗人S100A4的mAb。
　　5.對(duì)mAb進(jìn)行性質(zhì)鑒定，包括用Western-blot及交叉試驗(yàn)鑒定mAb的特異性，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，

4、ELISA)檢測(cè)mAb腹水效價(jià)及mAb的親和力等。
　　結(jié)果:
　　1.合成了人源S100A4基因全長(zhǎng)，并成功構(gòu)建人源S100A4蛋白表達(dá)載體pET32a-S100A4，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序證明基因序列完全一致。
　　2.成功進(jìn)行了人源S100A4蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定，其純度達(dá)到95％以上。Western-blot結(jié)果顯示非常清晰的免疫印跡條帶，表明重組蛋白具有免疫學(xué)特異性。腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)顯示人源S100A4

5、蛋白具有生物活性。
　　3.經(jīng)免疫小鼠、細(xì)胞融合后獲得6株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞系，Western-blot分析顯示，該mAb能與具有生物學(xué)活性的人源S100A4蛋白結(jié)合。成功制備鼠抗人S100A4蛋白單克隆抗體，腹水mAb效價(jià)可達(dá)204800。6株單抗的親和常數(shù)均達(dá)到108以上，表明抗原與抗體結(jié)合的緊密程度較高。交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6株單抗均具有較高的特異性，符合制備單克隆抗體的要求。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了

6、人源S100A4基因重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定、PCR特異性鑒定和序列比對(duì)分析證實(shí)為目的基因。
　　2.原核表達(dá)系統(tǒng)可高效表達(dá)重組人源S100A4蛋白。經(jīng)離子交換層析純化后可獲得高純度目的蛋白。腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)顯示人源S100A4蛋白具有生物活性。
　　3.成功建立了能穩(wěn)定分泌單抗的6株雜交瘤細(xì)胞系，制備出鼠抗人 S100A4蛋白的單克隆抗體，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，為進(jìn)一步用于人源S100A4的臨床檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)研究創(chuàng)造了條