犬冠狀病毒的分離鑒定及其S基因的克隆.pdf

1、2006年3月，公安部警犬技術(shù)學(xué)校2只警犬發(fā)病，經(jīng)初步診斷后，疑似犬冠狀病毒(CCV)病。我們對提供的犬冠狀病毒(CCV)癥狀病犬的糞便，以犬腎傳代細(xì)胞(MDCK)等多種細(xì)胞進(jìn)行了病毒分離，結(jié)果分離到1株病毒，在熒光顯微鏡下觀察到犬冠狀病毒的特征，進(jìn)而對該病毒進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、理化學(xué)、生物學(xué)鑒定以及RT-PCR鑒定等方面研究。最后將分離得到的CCV病毒S基因克隆到相應(yīng)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，這對進(jìn)一步研究CCv病毒的原核表達(dá)工作以及基因疫苗的研

2、制工作提供了必要的信息和資料，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果為： 1．從犬冠狀病毒(CCV)癥狀病犬糞便中分離出一株病毒，采用物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)該病毒有致細(xì)胞病變效應(yīng)；物理化學(xué)鑒定結(jié)果表明，分離病毒核酸類型為RNA，對氯仿、乙醚敏感，對1％胰蛋白酶不敏感，耐酸性較強(qiáng)，具有一定的耐熱性，無血凝性和紅細(xì)胞吸附特性；中和試驗(yàn)證明該分離病毒是一種犬冠狀病毒；動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)表明，本次分離病毒株可以引起試驗(yàn)犬

3、出現(xiàn)典型犬冠狀病毒病癥狀。 2．合成通用引物(2Bp，4Bm)和Matthew等設(shè)計(jì)的CCV S基因區(qū)特異性引物(CCVF2，CCVR2)對分離病毒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)及限制性內(nèi)切酶BastX Ⅰ酶切鑒定，并將純化的PCR產(chǎn)物成功地克隆到pGEM-T-easy載體中。結(jié)果為：通用引物(2Bp，4Bm)和特異性引物(CCVF2，CCVR2)擴(kuò)增均得到預(yù)期片段250bp,以及514bp，并且BstX Ⅰ酶切CCVF2、CCVR2的

4、PCR產(chǎn)物，于瓊脂糖凝膠上可見到大小為187 bp和327 bp兩個(gè)核苷酸片段。回收引物CCVF2，CCVR2擴(kuò)增得到長度約為514 bp較亮的DNA片段，并將其直接克隆到pGEM-T-easy載體中，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，并擴(kuò)增培養(yǎng)，對重組質(zhì)粒采用CCV特異性引物(CCVF2，CCVR2)進(jìn)行PCR，得到預(yù)期擴(kuò)增片段514bp,測序結(jié)果與GenBank的CCV序列進(jìn)行比對，與之相符。 結(jié)論： 1．形態(tài)學(xué)、理

5、化學(xué)、生物學(xué)及動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)等多方面鑒定，證明所分離病毒為犬冠狀病毒．RT-PCR反應(yīng)結(jié)果,BstX Ⅰ酶切鑒定均得到預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段，證明所分離病毒為犬冠狀病毒． 2．回收犬冠狀病毒特異性引物CCVF2，CCVR2擴(kuò)增的S蛋白特異性基因片斷并將其克隆入pGEM-T-easy載體中，進(jìn)行PCR鑒定及測序，結(jié)果表明成功構(gòu)建了pGEM-T-easy/CCV 重組質(zhì)粒． 3. S基因序列分析比較發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)出的CCV病毒和CC