莜麥類甜蛋白的分離與鑒定及其基因克隆.pdf

1、植物在與病原物長期協(xié)同進化過程中會形成一些有效的抗病機制，如細胞壁加厚、產(chǎn)生一些植物抗毒素、合成防御相關(guān)蛋白等。病程相關(guān)蛋白(pathogenesisrelatedproteins，PRPs)就是植物在病理或病理相關(guān)的條件下產(chǎn)生的一類具有廣譜抗活性的蛋白，最初由VanLoon和VanKammen等人應(yīng)用多聚腺苷酸誘導(dǎo)煙草抗病研究時發(fā)現(xiàn)，其廣泛地分布于單子葉和雙子葉植物中。根據(jù)氨基酸組成及生物學(xué)功能可將PRs分為17個家族，其中類甜蛋白(

2、TLPs)是PRs中第5家庭蛋白，即PR-5。由于該類蛋白常具有抗真菌活性，成為人們研究的熱點。目前已從單子葉植物、雙子葉植物、裸子植物、線蟲以及節(jié)肢動物中發(fā)現(xiàn)超過100種類甜蛋白。
　　 本課題組從莜麥種子分離到一種具有抗真菌活性的蛋白，質(zhì)譜分析表明，該蛋白屬于類甜蛋白。選取與該蛋白同源的EST序列，設(shè)計引物，以莜麥(nakedoats)幼苗cDNA為模板，利用RACE技術(shù)(rapid-amplificationofcDNAe

3、nds)擴增得到該TLP的編碼基因，命名為permatin。該基因開放閱讀框為678bp，編碼225個氨基酸。經(jīng)Blast比對，該基因編碼的氨基酸序列與禾本科植物小麥族中大麥、小麥、燕麥的TLPs相似度達80％以上。然后利用生物信息學(xué)軟件對該基因及編碼蛋白的各項理化性質(zhì)、與其他種屬TLPs的進化關(guān)系、二硫鍵位置、信號肽及其跨膜結(jié)構(gòu)等進行分析預(yù)測，并通過同源建模構(gòu)建其三級結(jié)構(gòu)模型，分析其結(jié)構(gòu)特征及可能的生物學(xué)功能。結(jié)果表明:該基因編碼蛋白

4、與大麥TLPs系統(tǒng)進化關(guān)系最為接近;前21個氨基酸殘基為典型的信號肽序，不具有跨膜結(jié)構(gòu)，可能是一種功能性分泌蛋白;編碼蛋白含有16個半胱氨酸殘基，可形成8對二硫鍵;二級結(jié)構(gòu)中含有類甜蛋白特有的保守序列;三級結(jié)構(gòu)中明顯的含三個結(jié)構(gòu)域和酸性“V”字形裂縫，推測其可能具有體外抗真菌活性。將該基因構(gòu)建至有助于含二硫鍵蛋白正確折疊的原核表達載體pET32L上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Origami(DE3)宿主菌中，利用IPTG誘導(dǎo)實現(xiàn)了permatin基