油菜硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與鑒定.pdf

1、油菜是世界第二大油料作物,也是我國(guó)最重要的油料作物。我國(guó)是世界油菜生產(chǎn)大國(guó),而長(zhǎng)江流域則是我國(guó)的主要油菜產(chǎn)區(qū),其種植面積和總產(chǎn)量均占全國(guó)的80％以上,但該區(qū)土壤普遍缺硼或嚴(yán)重缺硼。油菜是需硼量較大、對(duì)硼比較敏感的作物,缺硼會(huì)導(dǎo)致油菜花而不實(shí),嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。選育和推廣能耐低硼的油菜新品種是克服缺硼對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響的最為經(jīng)濟(jì)有效的對(duì)策,然而,常規(guī)方法改良油菜低硼耐性未見大的進(jìn)展。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展和硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與鑒定為改良

2、油菜低硼耐性開辟了新途徑。
　　 本研究首次從油菜中克隆硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因并進(jìn)行生物信息學(xué)、基因組中拷貝數(shù)和在不同器官中的表達(dá)譜分析,構(gòu)建該基因的過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化油菜以驗(yàn)證其功能,從而為基因工程改良油菜低硼耐性提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、克隆獲得油菜硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BnBOR并登錄GenBank(登錄號(hào)GU362414.1)。該基因的mRNA序列全長(zhǎng)2112 bp,編碼703個(gè)氨基酸,其gDNA序列包含

3、有11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子。
　　 2、生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,BnBOR是一個(gè)高分子量的跨膜蛋白,內(nèi)含11個(gè)推斷的跨膜功能域。同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析表明,BnBOR與擬南芥AtBOR1、AtBOR2和AtBOR3、水稻OsBOR1和OsBOR3以及萵苣、葡萄、柑橘、玉米、馬鈴薯、煙草和蓖麻等物種的硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因聚為同一大類,與這些硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性均在70％以上,其中與AtBOR1和AtB

4、OR2的推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別達(dá)到97％和91％。
　　 3、以硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的保守序列作為探針進(jìn)行Southern雜交分析,結(jié)果顯示有7條雜交條帶。由此推測(cè),同擬南芥和水稻一樣,甘藍(lán)型油菜中也可能存在多個(gè)不同的硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
　　 4、采用RT-PCR方法進(jìn)行油菜根、莖、葉、花和種子等不同器官中硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)譜分析,結(jié)果表明,硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在根和花中的表達(dá)較強(qiáng),莖和葉中次之,種子中最弱。
　　 5、

5、利用質(zhì)粒pFGC-5941將克隆的油菜硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因構(gòu)建成由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)載體,應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)用該載體轉(zhuǎn)化油菜下胚軸再生獲得一批抗性轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)PCR檢測(cè)共確認(rèn)陽(yáng)性植株36株。
　　 綜上所述,本研究首次克隆了油菜硼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,了解了該基因的生物學(xué)信息,基本明確了該基因在油菜基因組中的拷貝數(shù)和在不同器官中的表達(dá)譜,轉(zhuǎn)化獲得了該基因組成型過(guò)量表達(dá)的油菜轉(zhuǎn)基因植株36株,從而為后續(xù)研究打下了良好基礎(chǔ)。