犬冠狀病毒的感染特性及蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、本文分三部分論述了犬冠狀病毒的感染特性及蛋白質(zhì)組學： 第一部分利用A72細胞從經(jīng)RT-nPCR檢測陽性的腹瀉犬糞樣中分離CCV，經(jīng)RT-nPCR和免疫熒光試驗鑒定，成功分離到4株CCV野毒，分別命名為CCV KM、NJ2、NJ17、SH3。細胞適應性試驗表明，分離到的野毒在A72、ST、PK細胞上增殖， KM株可導致A72細胞圓縮、脫落，而NJ2、NJ17、SH3在A72細胞上不產(chǎn)生明顯的CPE。參考株CCV1-71及野毒KM、

2、NJ2(第8代)都可在A72、MDCK、F81、crFK等細胞上增殖，只有KM株可在Vero細胞上增殖，并可見明顯CPE。交叉保護試驗證明，抗KM的血清不能中和其他的CCV毒株，抗CCV1-71的血清可以中和野毒KM、NJ2但是不能中和另外的CCV野毒株HC、DF、HF，說明CCV的毒株的交叉保護性很有限。對分離株的部分M基因測序表明，本研究分離的CCVNJ2、NJ17、sH3與豬傳染性胃腸炎冠狀病毒(TGEV)的同源性達93.4-97

3、.2％)高于Ⅱ型貓冠狀病毒(FCoV)代表株FIPV 79-1683(75.9-79.7％)。而KM在系統(tǒng)進化樹上處于Ⅰ和Ⅱ型CCV之間，可能是一個新的變異株。 第二部分利用DNA熒光染料Hoechst 33258、細胞凋亡檢測試劑盒及流式細胞儀技術(shù)對CCV分離株及參考毒株CCV1-71、TGEV感染的A72細胞、ST細胞進行了檢測，以研究CCV感染對宿主細胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A72細胞上，分離毒株CCV KM、NJ2、N

4、J17和SH3幾乎對細胞的周期沒有影響，呈隱性感染狀態(tài)，而作為對照的CCV1-71和TGEV可在感染的晚期檢測到細胞凋亡現(xiàn)象。在ST細胞上，CCV分離株與TGEV在感染的早期未檢測到細胞的凋亡和細胞周期明顯改變，但是在感染晚期，可引起宿主細胞的凋亡。流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCV可引起感染細胞在s期聚集。 第三部分建立了穩(wěn)定的CCV1-71感染A72細胞體系。利用二維電泳技術(shù)對感染CCV1-71的A72細胞及同期對照細胞的細胞總

5、蛋白進行分離，對表達有差異的蛋白質(zhì)進行生物質(zhì)譜檢測(MALDI-TOF-Ms或二級串聯(lián)質(zhì)譜)分析。結(jié)果，48蛋白點與CCV感染有關(guān)，其中6個是病毒N蛋白，33個蛋白點的表達上調(diào)，9個蛋白點表達下調(diào)。本研究在蛋白質(zhì)的水平上揭示了宿主細胞對感染CCV的應答。CCV感染后，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯活動活躍，多種hnRNP表達上升和翻譯延伸因子表達有升有降。同時，細胞啟動對病毒感染的應激活動，表現(xiàn)為熱休克蛋白、TCP1、硫氧還蛋白及抗過氧化蛋白等分子伴