根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的簡青霉H5菌株遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、從基因水平來研究絲狀真菌對木質(zhì)素的降解作用具有重要的意義,近年來發(fā)展的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.ATMT)與傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法相比較,具有高效、穩(wěn)定、高頻單拷貝隨機插入、適用范圍廣等優(yōu)點,非常適合于絲狀真菌的分子遺傳學(xué)研究。
　　 簡青霉(Penicillium simplicissimum)H5是由湖南大學(xué)從土壤中分離得到的一株

2、真菌,該菌具有木質(zhì)纖維素降解活力,但其作用機制和產(chǎn)酶特點尚未得到有效地闡明。本文建立由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的簡青霉H5菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系,為該菌的功能基因組研究及其基因工程改造提供強有力的工具。
　　 本文將含有潮霉素抗性(Hygromycin Resistance)的載體質(zhì)粒pBHt1通過凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1中,與H5孢子共培養(yǎng)兩天后篩選得到具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。潮霉素抗性篩選、PCR和Southern blot分子鑒定

3、等結(jié)果表明:篩選獲得的轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳,外源的T-DNA以單拷貝隨機整合到簡青霉的基因組中。
　　 通過對實驗得到的轉(zhuǎn)化子進行剛果紅平板脫色實驗檢測,發(fā)現(xiàn)了一株在營養(yǎng)限制培養(yǎng)基上生長狀況強于野生型的轉(zhuǎn)化子,而且產(chǎn)纖維素酶的能力也明顯高于野生型。轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后,將培養(yǎng)液用硫酸銨沉降并透析純化所得到的蛋白產(chǎn)物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,檢測該轉(zhuǎn)化子在液體培養(yǎng)條件下胞外蛋白的總產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同條件下該轉(zhuǎn)化子的胞