Cx26與PI3K-Akt信號(hào)通路相互激活促進(jìn)EMT介導(dǎo)的NSCLC吉非替尼獲得性耐藥的研究.pdf

1、目的:研究Connexin26(Cx26)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lungcancer，NSCLC)上皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和吉非替尼獲得性耐藥的影響及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.用蛋白免疫印跡(Western blot，WB)、RT-PCR(reverse transcriptionPCR)法檢測(cè)4種縫隙連接蛋白(Connexins

2、，Cxs) Cx26、Cx32、Cx31.1及Cx43在4株人NSCLC細(xì)胞系HCC827、PC9、A549、NCI-H1299中的表達(dá)水平。
　　2.用誘導(dǎo)耐藥的方法，在人NSCLC細(xì)胞系HCC827、PC9的培養(yǎng)基中，按濃度梯度逐步增加吉非替尼濃度，以1.0μM的吉非替尼終濃度維持細(xì)胞耐藥性，構(gòu)建吉非替尼誘導(dǎo)耐藥株HCC827 GR和PC9 GR細(xì)胞。使用噻唑藍(lán)（Tetrazolium-based colorimetric a

3、ssay，MTT）法檢測(cè)以上細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）值。
　　3.用熒光示蹤法(parachute assay)檢測(cè)人NSCLC細(xì)胞株HCC827、PC9及其誘導(dǎo)耐藥株HCC827 GR、PC9 GR細(xì)胞間的縫隙連接功能(gapjunctional intercellular communication，GJIC);使用免疫熒光技術(shù)(Immunofl

4、uorescence staining，IF)檢測(cè)NSCLC細(xì)胞株HCC827、PC9及其誘導(dǎo)耐藥株HCC827 GR、PC9 GR細(xì)胞中Cx26的蛋白定位。
　　4.用慢病毒(lentivirus)載體技術(shù)對(duì)人NSCLC細(xì)胞中Cx26蛋白表達(dá)進(jìn)行干擾和過表達(dá);用pcDNA3.1-Akt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)人NSCLC細(xì)胞中Akt蛋白進(jìn)行過表達(dá)，用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002對(duì)Akt蛋白表達(dá)進(jìn)行抑制;用WB檢測(cè)人NSCLC細(xì)

5、胞中Cx26、E-cadherin、vimentin、slug、Akt及p-Akt的表達(dá)水平。使用Transwell小室法檢測(cè)人NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力。
　　5.BALB/c裸鼠分別皮下接種200μL1×107個(gè)HCC827、HCC827 GR、HCC827 GR-shCx26細(xì)胞。當(dāng)腫瘤體積((長(zhǎng)×寬2)/2）達(dá)到100 mm3時(shí)，分別給予吉非替尼（100 mg/kg/d，灌胃）或LY294002（25 mg/kg，腹腔

6、注射，一周2次）或聯(lián)合給藥。給藥作用15天后處死裸鼠，每3天測(cè)量一次腫瘤體積，繪制腫瘤增殖曲線。
　　結(jié)果:
　　1.WB和RT-PCR結(jié)果顯示，在4株人NSCLC細(xì)胞系HCC827、PC9、A549、NCI-H1299中，Cx26、Cx32、Cx31.1和Cx43的表達(dá)具有差異性，其中Cx26是主要表達(dá)的Cxs亞型，并且Cx26在吉非替尼耐藥細(xì)胞株A549、NCI-H1299中表達(dá)均高于吉非替尼敏感細(xì)胞株HCC827、PC

7、9。
　　2.MTT結(jié)果顯示，HCC827、HCC827 GR和PC9、PC9 GR細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50值分別為0.06±0.11μM、12.17±0.18μM及0.25±0.07μM、16.51±0.17μM。形態(tài)學(xué)顯示，HCC827 GR、PC9-GR細(xì)胞表現(xiàn)分散、細(xì)長(zhǎng)、間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài);上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、slug的表達(dá)增多;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC827 GR

8、、PC9-GR細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng);WB結(jié)果顯示，HCC827 GR、PC9 GR細(xì)胞中Cx26的表達(dá)量顯著增多。
　　3.熒光示蹤法結(jié)果顯示，以人包皮成纖維細(xì)胞(HFFS)作為陽(yáng)性對(duì)照，HFFS細(xì)胞用RA（GJIC增強(qiáng)劑）處理后能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞間的GJIC功能。但是HCC827、HCC827 GR和PC9、PC9 GR細(xì)胞間縫隙連接功能缺失，用RA處理后并未能增強(qiáng)細(xì)胞間的GJIC功能。免疫熒光結(jié)果顯示，Cx26表達(dá)在HC

9、C827、PC9及HCC827 GR、PC9 GR細(xì)胞胞漿。
　　4.在吉非替尼敏感株HCC827、PC9細(xì)胞上過表達(dá)Cx26后，HCC827-Cx26、PC9-Cx26細(xì)胞表現(xiàn)分散、細(xì)長(zhǎng)、間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài);上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、slug的表達(dá)增多;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC827-Cx26、PC9-Cx26細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)。MTT結(jié)果表明，HCC827-Cx26

10、、PC9-Cx26細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性顯著增高。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，與HCC827-mock、PC9-mock組相比，過表達(dá)Cx26使HCC827、PC9組腫瘤體積顯著增大。
　　5.在對(duì)吉非替尼耐藥的HCC827 GR、PC9 GR細(xì)胞上干擾Cx26的表達(dá)后，HCC827 GR-shCx26、PC9 GR-shCx26細(xì)胞的分散、細(xì)長(zhǎng)、間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài)被部分逆轉(zhuǎn);上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、

11、slug的表達(dá)下降;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC827 GR-shCx26、PC9 GR-shCx26細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著減弱。MTT結(jié)果表明，HCC827GR-shCx26、PC9 GR-shCx26細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性顯著增高。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，與HCC827 GR-scramble、PC9 GR-scramble組相比，干擾Cx26使HCC827 GR、PC9 GR組腫瘤體積增大被部分逆轉(zhuǎn)。
　　6.WB結(jié)果

12、顯示，在對(duì)吉非替尼敏感的HCC827、PC9細(xì)胞中過表達(dá)Cx26后，p-Akt的表達(dá)量顯著增多;在對(duì)吉非替尼耐藥的HCC827 GR、PC9 GR細(xì)胞中干擾Cx26后，p-Akt的表達(dá)量顯著降低。用LY294002處理HCC827-Cx26、PC9-Cx26細(xì)胞后，形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，LY294002能夠部分逆轉(zhuǎn)上述細(xì)胞的間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變;上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)增多，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、slug的表達(dá)減少;Transwell實(shí)

13、驗(yàn)結(jié)果顯示，LY294002能夠拮抗過表達(dá)Cx26對(duì)HCC827、PC9細(xì)胞的促遷移和促侵襲效應(yīng)。MTT結(jié)果表明，LY294002能夠拮抗過表達(dá)Cx26對(duì)HCC827、PC9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，與HCC827-mock、PC9-mock組相比，LY294002處理后能夠抑制過表達(dá)Cx26引起的HCC827、PC9組的腫瘤體積的增大。
　　7.在HCC827、PC9細(xì)胞中過表達(dá)Akt后，HCC827、PC9細(xì)胞

14、表現(xiàn)出分散、細(xì)長(zhǎng)、間質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài);上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、slug的表達(dá)增多;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Akt后HCC827、PC9細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)。MTT結(jié)果顯示，過表達(dá)Akt后HCC827、PC9組對(duì)吉非替尼的敏感性顯著降低。在過表達(dá)Akt的HCC827、PC9細(xì)胞中進(jìn)一步過表達(dá)Cx26蛋白后，能進(jìn)一步增強(qiáng)上述效應(yīng)。而在過表達(dá)Akt的HCC827、PC9細(xì)胞中干擾C

15、x26蛋白的表達(dá)后，能夠部分拮抗上述效應(yīng)。此外，WB結(jié)果顯示，在HCC827、PC9、HCC827GR、PC9 GR細(xì)胞用特異性PI3K/Akt通路抑制劑LY294002抑制PI3K/Akt通路活性后，Cx26的表達(dá)下降;在上述細(xì)胞中用質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)過表達(dá)Akt后，Cx26的表達(dá)隨之增多。
　　結(jié)論:Cx26上調(diào)與非小細(xì)胞肺癌吉非替尼獲得性耐藥呈正相關(guān);Cx26與PI3K/Akt信號(hào)通路之間的相互激活促進(jìn)EMT介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌吉非替尼