非小細(xì)胞肺癌中miR-497作用于IGF-1R信號(hào)通路對(duì)吉非替尼獲得性耐藥影響的研究.pdf

1、目的：1、建立吉非替尼穩(wěn)定耐藥的人非小細(xì)胞肺腺癌A549/GR細(xì)胞株；2、探討胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(Insulin-like growth factor1 receptor，IGF-1R)及其下游信號(hào)分子磷酸化蛋白激酶B1（p-AKT1）與肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)生吉非替尼獲得性耐藥之間的關(guān)系；3、高表達(dá)耐藥細(xì)胞內(nèi)的微小RNA-497（miR-497）后，探討非小細(xì)胞肺癌中miR-497作用于IGF-1R信號(hào)通路對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的影響

2、。
　　方法：1、體外無菌環(huán)境下培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌A549親本細(xì)胞株，并通過低濃度藥物逐步加量誘導(dǎo)的方法，建立吉非替尼耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549/GR；2、倒置顯微鏡下觀察自然生長(zhǎng)狀態(tài)下及HE染色后耐藥細(xì)胞株A549/GR形態(tài)學(xué)的變化，MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同藥物濃度作用下A549及A549/GR細(xì)胞株的細(xì)胞活力，確定A549/GR細(xì)胞株對(duì)吉非替尼的耐藥程度；3、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)檢測(cè)親本株A549及耐藥

3、株A549/GR細(xì)胞中IGF-1R蛋白及其下游 p-AKT1的表達(dá)情況；4、以耐藥細(xì)胞株 A549/GR為模型，運(yùn)用RiboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)miR-497 mimic進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，高表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的miR497，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況；5、MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染前后耐藥細(xì)胞對(duì)吉非替尼耐藥性的改變；6、Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后耐藥細(xì)胞中IGF-1R蛋白及其下游信號(hào)分子p-AKT1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、吉非替

4、尼誘導(dǎo)培養(yǎng)10個(gè)月后，建立的耐藥株A549/GR細(xì)胞可在40μmol/L吉非替尼濃度的培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)；2、倒置顯微鏡下觀察親本株A549及耐藥株A549/GR均為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞大小不一，A549細(xì)胞形態(tài)主要為多邊形，而耐藥株A549/GR細(xì)胞形態(tài)多為紡錘狀，且核分裂現(xiàn)象較親本株明顯；3、MTT法測(cè)得A549細(xì)胞株半數(shù)抑制藥物濃度為（8.90±0.48）μmol/L，A549/GR細(xì)胞株半數(shù)抑制藥物濃度為（51.96±2.39）μmol

5、/L(P＜0.01)，耐藥指數(shù)為5.84；4、Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示，A549/GR細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達(dá)水平較A549細(xì)胞升高(P＜0.05)，且p-AKT1的表達(dá)量增加（P＜0.05）；5、耐藥細(xì)胞株A549/GR轉(zhuǎn)染miR-497 mimic后熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效果良好（如圖4示）；6、MTT法顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株A549/GR-miR497-mimic半數(shù)抑制藥物濃度為（33.76±0.97）μmol/L，是陰性對(duì)

6、照組的0.65倍(P＜0.01)；7、Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)得miR-497高表達(dá)后的耐藥細(xì)胞株A549/GR-miR497-mimic中IGF-1R及p-AKT1蛋白表達(dá)水平均低于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.成功建立對(duì)吉非替尼穩(wěn)定耐藥的非小細(xì)胞肺癌A549/GR細(xì)胞株，且其細(xì)胞的形態(tài)改變與耐藥性的相符；2.在耐藥細(xì)胞株A549/GR中，IGF-1R蛋白及其下游信號(hào)分子p-AKT1的表達(dá)量較親本細(xì)胞株增高，

7、表明IGF-1R及其下游AKT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼獲得性耐藥；3.在耐藥細(xì)胞株A549/GR中高表達(dá)miR-497后，耐藥細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性降低，推測(cè)高表達(dá)miR-497后可以提高A549/GR耐藥細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（ epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor， EGFR-TKIs）的敏感性；4、在耐藥細(xì)