IGF-1R旁路相關(guān)miRNA與非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs耐藥關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　1.利用小干擾 RNA(siRNA)沉默耐吉非替尼 A549（A549/GR）細(xì)胞的胰島素生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）基因,為進(jìn)一步探討IGF-1R信號(hào)通路的激活對(duì)肺腺癌表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑（EGFR-TKIs）的耐藥性研究提供細(xì)胞模型;
　　2.探討IGF-1R旁路相關(guān)微小RNA（miRNA）與EGFR-TKIs耐藥的關(guān)系。
　　方法:
　　1. A549/GR由前期實(shí)驗(yàn)獲得，復(fù)蘇A549/GR

2、細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定A549/GR對(duì)A549的耐藥倍數(shù)；
　　2.設(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對(duì)IGF-1R基因編碼區(qū)的siRNA3對(duì)，并以1對(duì)無(wú)關(guān)序列的寡核苷酸作為陰性對(duì)照。將化學(xué)合成siRNA用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染至A549/GR細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為6組：siRNA-1組、siRNA-2組siRNA-3組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后48h應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)IGF-1R siRNA轉(zhuǎn)染的基因干擾效率;
　　

3、3.miRNA芯片檢測(cè)A549/GR與IGF-1R-siRNA-A549/GR中miRNA的表達(dá)差異。
　　4.RT-PCR驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1. CCK-8法測(cè)得A549/GR細(xì)胞的耐藥指數(shù)為親代細(xì)胞的6.00倍；A549/GR細(xì)胞倍增時(shí)間較A549細(xì)胞縮短（31.97h VS.34.85 h，p＜0.01）；
　　2.成功構(gòu)建了 IGF-1R基因表達(dá)沉默的 A549/GR細(xì)胞株模型，R

4、T—PCR結(jié)果顯示siRNA實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比IGF-1R mRNA的的表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中siRNA-2組的沉默效率最高，為72％;
　　3.通過(guò)對(duì)A549/GR與IGF-1R-siRNA-A549/GR中miRNA表達(dá)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05的miRNAs有72條，其中在IGF-1R-siRNA-A549/GR中上調(diào)的有13條，包括miR-497-3p、miR-1273c等；下調(diào)的有59條，包括m

5、iR-361-3p、miR-345-3p等;
　　4.將miRNA芯片中差異表達(dá)較顯著且信號(hào)值較高的10條miRNAs進(jìn)一步采用RT-PCR驗(yàn)證，其中10條均與芯片結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了IGF-1R基因表達(dá)沉默的人肺腺癌A549/GR細(xì)胞株模型。
　　2. miRNA芯片是篩選差異表達(dá)miRNA的有效工具。
　　3.IGF-1R沉默組與對(duì)照組miRNA表達(dá)差異顯著，IGF-1R旁路相關(guān)m