簡介：第二十五章免疫學(xué)診斷,教學(xué)要求1掌握凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的定義及其基本類型。2掌握間接免疫熒光法和ELISA的雙抗夾心法及間接法的基本操作步驟。3熟悉檢測體液免疫和細(xì)胞免疫的常用試驗(yàn)方法。4了解免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用。,第二十四章免疫學(xué)診斷,免疫學(xué)診斷即用免疫學(xué)方法確定疾病相關(guān)因子、監(jiān)測疾病過程、判斷療效及預(yù)后，涉及對疾病相關(guān)因子的診斷和輔助診斷，以及檢測機(jī)體免疫功能狀態(tài)。第一節(jié)抗原或抗體的檢測抗原抗體反應(yīng)原理抗原的抗原決定基與抗體的結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)應(yīng)具有互補(bǔ)性，二者相互結(jié)合后，在適宜條件下，可出現(xiàn)可見反應(yīng)。,免疫學(xué)診斷,一、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)（一）抗原抗體反應(yīng)的特異性指一種抗原只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的專一性。它是免疫學(xué)診斷的重要基礎(chǔ)。1親和力AFFINITY抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合強(qiáng)度。2親合力AVIDITY一個(gè)抗體分子與整個(gè)抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度。3抗血清4一抗5二抗,免疫學(xué)診斷,（二）抗原抗體反應(yīng)的可見性抗原、抗體比例適合時(shí)，在適宜的鹽濃度下可形成肉眼可見的反應(yīng)物（凝集物或沉淀物）。（三）抗原抗體反應(yīng)的可逆性抗原抗體之間的結(jié)合主要是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，穩(wěn)定，但在適當(dāng)條件（如低PH、高濃度鹽、凍融等）下可解離開，各自的生物學(xué)特性不發(fā)生改變。根據(jù)此特點(diǎn)，可利用親合層析法純化抗原或抗體。,,（五）影響抗原抗體反應(yīng)的因素P3791溫度適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子碰撞的機(jī)會(huì)，加快二者結(jié)合速度。不宜過高過低。2電解質(zhì)可使IC復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)。常用生理鹽水稀釋抗原或抗體。,免疫學(xué)診斷,3酸堿度最適PH6～8，否則可出現(xiàn)假陰或假陽性結(jié)果4抗原和抗體性質(zhì)抗體的特異性和親和力是關(guān)鍵，初次應(yīng)答抗體親和力低，單克隆抗體親和力低；抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡等。,二抗原或抗體的檢測方法,根據(jù)抗原的性質(zhì)、出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分不同，可將抗原抗體反應(yīng)分為下列幾類（一）凝集反應(yīng)（AGGLUTINATIONP381細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在適宜電解質(zhì)下形成肉眼可見凝集物的反應(yīng)。,,1直接凝集玻片和試管凝集2間接凝集正相間接凝集和反向間接凝集。補(bǔ)充介紹3協(xié)同凝集以SPA為載體的反向間接凝集。在微生物檢測中常用。4間接凝集抑制試驗(yàn),,,抗原或抗體的檢測方法,（二）沉淀反應(yīng)（PRECIPITATIONP380血清蛋白質(zhì)、細(xì)菌裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時(shí)，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的反應(yīng)。1單向免疫擴(kuò)散SINGLEIMMUNODIFFUSION（1）特點(diǎn)定性定量試驗(yàn)（2）用途可用于測定血清IGG,IGM,IGA和C3等的含量（3）原理沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)。（4）操作鋪板打孔加樣放濕盒看結(jié)果。,,,,,,,,,,,,,,,2雙向免疫擴(kuò)散DOUBLEIMMUNODIFFUSION（1）特點(diǎn)定性半定量（2）用途用于抗原或抗體的定性檢測、組成和多抗原相關(guān)性分析。（3）操作鋪板打孔加樣放濕盒看結(jié)果。,,,,,,3對流免疫電泳試驗(yàn)（補(bǔ)充介紹）其實(shí)質(zhì)是將雙擴(kuò)與電泳相結(jié)合。（1）特點(diǎn)定性試驗(yàn)（2）用途主要用于病原微生物抗原的定性檢測。（3）操作鋪板打孔加樣電泳看結(jié)果。,,,,,,,,4免疫電泳（IMMUNOELECTROPHORESIS也是將電泳技術(shù)與雙向免疫擴(kuò)散結(jié)合的一種技術(shù)，先電泳后雙向免疫擴(kuò)散（見圖）。,,5免疫比濁（IMMUNOEPHELOMETRY）在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間形成IC，液體渾濁，用濁度計(jì)測反應(yīng)體系的濁度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中抗原含量。,,（四）免疫標(biāo)記技術(shù)P381用熒光素、酶、放射性核素等標(biāo)記抗原或抗體后進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。提高檢測靈敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫熒光標(biāo)記技術(shù),1免疫熒光法可對標(biāo)本中的抗原進(jìn)行鑒定和定位。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE），前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。用途可用于檢查細(xì)菌、病毒、螺旋體等的抗原或抗體，幫助診斷傳染??；也可用于鑒定免疫細(xì)胞的CD分子，檢測AID的抗核抗體等。,,（1）直接法缺點(diǎn)是每檢查一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。（2）間接法敏感性比直接法高，制備一種熒光二抗可用于多種抗原的檢查，但非特異性增多。,,,,,,2酶免疫測定是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合。敏感度可達(dá)1UG/L,甚至1NG/L。常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）等。常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY,ELISA）測定可溶性抗原或抗體，用酶免疫組化法測定,免疫酶標(biāo)記技術(shù),組織中或細(xì)胞表面的抗原。（1）ELISA①雙抗體夾心法用于檢測可溶性的特異性抗原。操作基本步驟用已知抗體包板洗滌封板洗滌加入待檢標(biāo)本洗滌加酶標(biāo)抗體洗滌加底物顯色結(jié)果觀察。,,,,,,,,,,免疫酶標(biāo)記技術(shù),②間接法檢測特異性抗體。非特異性增加?；静襟E用已知抗原包板加入待檢標(biāo)本加酶標(biāo)二抗加底物顯色觀察結(jié)果。,,,,,,,免疫標(biāo)記技術(shù),（2）酶免疫組化法將酶標(biāo)抗體與組織或細(xì)胞表面的抗原反應(yīng)后，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查，對抗原進(jìn)行定性、定量、定位檢測。3放射免疫測定法用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測，敏感度可達(dá)PG水平。常用于檢測微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、嗎啡、地高辛藥物和IGE等。,,4免疫印跡法P383又稱WESTERNBLOTTING，用于蛋白質(zhì)檢測。是將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體后，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。?？蓹z測多種病毒的抗原或抗體。,第二節(jié)淋巴細(xì)胞的測定,淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，檢測其數(shù)量和功能是了解機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。一淋巴細(xì)胞的分離常用FICOLL（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心除去紅細(xì)胞、粒細(xì)胞而獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），再經(jīng)吸附除去單核細(xì)胞而得到淋巴細(xì)胞。若要分離T細(xì)胞，可用尼龍毛柱、抗CD3單抗、E花結(jié)試驗(yàn)等分離。,,,二、淋巴細(xì)胞的鑒定P386根據(jù)淋巴細(xì)胞的某些標(biāo)志，采用免疫熒光法、磁珠分離法、流式細(xì)胞術(shù)等方法可確定細(xì)胞的不同類型和比例。（一）T細(xì)胞功能測定1T細(xì)胞增殖試驗(yàn)植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（CONA）等絲裂原及抗CD3單抗等能非特異性激活培養(yǎng)的T細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞的試驗(yàn)。,淋巴細(xì)胞功能測定,在該增殖過程中，細(xì)胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，細(xì)胞形態(tài)改變。也可檢測特異性抗原致敏的T細(xì)胞。（1）氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入法該法靈敏、可靠，應(yīng)用廣泛，但需特殊儀器（液體閃爍儀），易有放射性污染。（2）MTT法該法操作簡單，無放射性污染，但敏感性相對較差。,淋巴細(xì)胞功能測定,2細(xì)胞毒試驗(yàn)TC、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞有直接殺傷作用，可根據(jù)待檢效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)的靶細(xì)胞。（1）51CR釋放法用51CR標(biāo)記靶細(xì)胞，Γ記數(shù)儀測定釋放的51C活性。（2）MTT法其原理與增殖試驗(yàn)相同，但甲生成量與靶細(xì)胞溶解破壞水平呈負(fù)相關(guān)。,,3細(xì)胞因子檢測CK的檢測有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細(xì)胞，監(jiān)測某些疾病狀態(tài)的細(xì)胞免疫功能。常用的檢測方法有以下三種（1）ELISA法（2）生物活性測定法（3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,淋巴細(xì)胞功能測定,4皮膚實(shí)驗(yàn)正常機(jī)體對某種抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫后，用相同抗原做皮膚試驗(yàn)時(shí)出現(xiàn)以局部紅腫為特征的DTH。細(xì)胞免疫正常時(shí)出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下則呈陰性反應(yīng)。該方法簡便，可幫助診斷某些病原微生物感染（如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌等）及免疫缺陷病等。,淋巴細(xì)胞功能測定,（二）B細(xì)胞功能測定P389B細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫，檢查B細(xì)胞的數(shù)量與功能是確定體液免疫是否正常的重要手段。1B細(xì)胞增殖試驗(yàn)2抗體形成細(xì)胞的測定吸附有特異性抗原的SRBC與抗體形成細(xì)胞分泌的IG特異性結(jié)合后活化補(bǔ)體，溶解SRBC。又稱溶血空斑試驗(yàn)。,,第四節(jié)免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用（自學(xué)）,
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