第五章細(xì)胞因子-醫(yī)學(xué)全在線-國家醫(yī)學(xué)考試網(wǎng)國家醫(yī)學(xué)教育

1、第二十五章      免 疫 學(xué) 診 斷,教 學(xué) 要 求:1 掌握凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的定義及其基本類型。2 掌握間接免疫熒光法和ELISA的雙抗夾心法及間接法的基本操作步驟。3 熟悉檢測體液免疫和細(xì)胞免疫的常用試驗方法。4 了解免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用。,第二十四章      免疫學(xué)診斷,免疫學(xué)診斷即用免

2、疫學(xué)方法確定疾病相關(guān)因子、監(jiān)測疾病過程、判斷療效及預(yù)后，涉及對疾病相關(guān)因子的診斷和輔助診斷，以及檢測機體免疫功能狀態(tài)。 第一節(jié) 抗原或抗體的檢測 抗原抗體反應(yīng)原理：抗原的抗原決定基與抗體的結(jié)合部位之間的結(jié)構(gòu)應(yīng)具有互補性，二者相互結(jié)合后，在適宜條件下，可出現(xiàn)可見反應(yīng)。,免疫學(xué)診斷,一、抗原抗體反應(yīng)的特點（一）抗原抗體反應(yīng)的特異性

3、 指一種抗原只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合的專一性。它是免疫學(xué)診斷的重要基礎(chǔ)。 1 親和力(affinity)：抗體分子上一個抗原結(jié)合部位與相應(yīng)的抗原決定基之間的結(jié)合強度。 2 親合力(avidity):一個抗體分子與整個抗原之間的結(jié)合強度。 3 抗血清： 4 一抗： 5 二抗：,免疫學(xué)診斷,（二）抗原抗體反應(yīng)的可見性： 抗原、抗體比例適合時，在適

4、宜的鹽濃度下可形成肉眼可見的反應(yīng)物（凝集物或沉淀物）。（三）抗原抗體反應(yīng)的可逆性： 抗原抗體之間的結(jié)合主要是分子表面的非共價鍵結(jié)合，穩(wěn)定，但在適當(dāng)條件（如低pH、高濃度鹽、凍融等）下可解離開，各自的生物學(xué)特性不發(fā)生改變。根據(jù)此特點，可利用親合層析法純化抗原或抗體。,,（五）影響抗原抗體反應(yīng)的因素：P379 1 溫度：適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子碰撞的機會， 加快二者結(jié)合速度。不宜過高過低。2 電解

5、質(zhì)：可使IC復(fù)合物失去電荷而凝聚，出現(xiàn)可見反應(yīng)。常用生理鹽水稀釋抗原或抗體。,免疫學(xué)診斷,3 酸堿度：最適pH6～8，否則可出現(xiàn)假陰或假陽性結(jié)果 4 抗原和抗體性質(zhì)：抗體的特異性和親和力是關(guān)鍵，初次應(yīng)答抗體親和力低，單克隆抗體親和力低；抗原理化性質(zhì)、抗原表位多寡等。,二 抗原或抗體的檢測方法,根據(jù)抗原的性質(zhì)、出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分不同，可將抗原抗體反應(yīng)分為下列幾類： （一）凝集反應(yīng)（agglutination)

6、 P381 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在適宜電解質(zhì)下形成肉眼可見凝集物的反應(yīng)。,,1. 直接凝集：玻片和試管凝集2 間接凝集： 正相間接凝集和反向間接凝集。 補充介紹：3. 協(xié)同凝集：以SPA為載體的反向間接凝集。在微生物檢測中常用。4. 間接凝集抑制試驗：,,,抗原或抗體的檢測方法,（二）沉淀反應(yīng)（precipitation)： p380

7、 血清蛋白質(zhì)、細(xì)菌裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物的反應(yīng)。 1 單向免疫擴散 (single immunodiffusion)（1）特點：定性定量試驗（2）用途：可用于測定血清IgG,IgM,IgA和C3等的含量（3）原理：沉淀環(huán)的直徑與抗原含量呈正相關(guān)。（4）操作：鋪板 打孔 加樣

8、 放濕盒 看結(jié)果。,,,,,,,,,,,,,,,2 雙向免疫擴散(double immunodiffusion)（1）特點：定性半定量（2）用途：用于抗原或抗體的定性檢測、組成和多抗原相 關(guān)性分析。（3）操作：鋪板 打孔 加樣 放濕盒 看結(jié)果 。,,,,,,3 對流免疫電泳試驗 （補充介紹） 其實質(zhì)是將

9、雙擴與電泳相結(jié)合。（1）特點：定性試驗（2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性檢測。（3）操作：鋪板 打孔 加樣 電泳 看結(jié)果 。,,,,,,,,4 免疫電泳 （immunoelectrophoresis) 也是將電泳技術(shù)與雙向免疫擴散結(jié)合的一種技術(shù)，先電泳后雙向免疫擴散（見圖） 。,,5 免疫比濁 （immunoephel

10、ometry） 在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間形成IC，液體渾濁，用濁度計測反應(yīng)體系的濁度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中抗原含量。,,（四）免疫標(biāo)記技術(shù) P381 用熒光素、酶、放射性核素等標(biāo)記抗原或抗體后進行抗原抗體反應(yīng)。提高檢測靈敏度、快速、可定性、定量，定位等。,免疫熒光標(biāo)記技術(shù),1 免疫熒光法 可對標(biāo)本中的抗原進行鑒定和定位。常用的

11、熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）和藻紅蛋白（PE），前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。 用途：可用于檢查細(xì)菌、病毒、螺旋體等的抗原或抗體，幫助診斷傳染病；也可用于鑒定免疫細(xì)胞的CD分子，檢測AID的抗核抗體等。,,（1）直接法：缺點是每檢查一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。（2）間接法：敏感性比直接法高，制備一種熒光二抗可用于多種抗原的檢查，但非特異性增多。,,,,,,2. 酶免疫測定： 是將

12、抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合。敏感度可達1ug/L,甚至1ng/L。常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）等。 常用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）測定可溶性抗原或抗體，用酶免疫組化法測定,免疫酶標(biāo)記技術(shù),組織中或細(xì)胞表面的抗原。（1）ELISA: ① 雙抗體夾心法：用于檢測可溶性的特異性抗原。

13、 操作基本步驟：用已知抗體包板 洗滌 封板 洗滌 加入待檢標(biāo)本 洗滌 加酶標(biāo)抗體 洗滌 加底物顯色 結(jié)果觀察。,,,,,,,,,,免疫酶標(biāo)記技術(shù),②間接法：檢測特異性抗體。非特異性增加。 基本步驟：用已知抗原包板 加入待檢標(biāo)本

14、 加酶標(biāo)二抗 加底物顯色 觀察結(jié)果。,,,,,,,免疫標(biāo)記技術(shù),（2）酶免疫組化法： 將酶標(biāo)抗體與組織或細(xì)胞表面的抗原反應(yīng)后，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查，對抗原進行定性、定量、定位檢測。 3 放射免疫測定法： 用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進行免疫學(xué)檢測，敏感度可達pg水平。常用于檢測微量物質(zhì)，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、嗎啡、地高辛藥物和

15、IgE等。,,4 免疫印跡法：P383 又稱Western-blotting，用于蛋白質(zhì)檢測。是將凝膠電泳與固相免疫結(jié)合，把電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體后，再用酶免疫、放射免疫等技術(shù)測定。?？蓹z測多種病毒的抗原或抗體。,第二節(jié) 淋巴細(xì)胞的測定,淋巴細(xì)胞是機體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，檢測其數(shù)量和功能是了解機體免疫狀態(tài)的重要手段。 一 淋巴細(xì)胞的分離 常用fico

16、ll（淋巴細(xì)胞分離液）密度梯度離心除去紅細(xì)胞、粒細(xì)胞而獲得外周血單個核細(xì)胞（PBMC），再經(jīng)吸附除去單核細(xì)胞而得到淋巴細(xì)胞。若要分離T細(xì)胞，可用尼龍毛柱、抗CD3單抗、E花結(jié)試驗等分離。,,,二、淋巴細(xì)胞的鑒定 P386 根據(jù)淋巴細(xì)胞的某些標(biāo)志，采用免疫熒光法、磁珠分離法、流式細(xì)胞術(shù)等方法可確定細(xì)胞的不同類型和比例。（一）T細(xì)胞功能測定 1. T細(xì)胞增殖試驗

17、 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）等絲裂原及抗CD3單抗等能非特異性激活培養(yǎng)的T細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞的試驗。,淋巴細(xì)胞功能測定,在該增殖過程中，細(xì)胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，細(xì)胞形態(tài)改變。也可檢測特異性抗原致敏的T細(xì)胞。 （1）氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入法：該法靈敏、可靠，應(yīng)用廣泛，但需特殊儀器（液體閃爍儀），易有放射性污染。 （2）MTT法：該法操作簡單，無放射性污染，但敏感性相對較差。,淋巴

18、細(xì)胞功能測定,2 細(xì)胞毒試驗： Tc、NK細(xì)胞對靶細(xì)胞有直接殺傷作用，可根據(jù)待檢效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)的靶細(xì)胞。 （1）51Cr釋放法：用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，γ記數(shù)儀測定釋放的51C活性。 （2）MTT法：其原理與增殖試驗相同，但甲 生成量與靶細(xì)胞溶解破壞水平呈負(fù)相關(guān)。,,3 細(xì)胞因子檢測： CK的檢測有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細(xì)胞，監(jiān)測某些

19、疾病狀態(tài)的細(xì)胞免疫功能。常用的檢測方法有以下三種：（1）ELISA法：（2）生物活性測定法：（3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：,淋巴細(xì)胞功能測定,4 皮膚實驗 正常機體對某種抗原產(chǎn)生細(xì)胞免疫后，用相同抗原做皮膚試驗時出現(xiàn)以局部紅腫為特征的DTH。細(xì)胞免疫正常時出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細(xì)胞免疫低下則呈陰性反應(yīng)。 該方法簡便，可幫助診斷某些病原微生物感染（如結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌等）及免疫缺陷病等