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    • 簡介:目的干細(xì)胞是一種能夠高度自我增殖、未充分分化不成熟的、具有再生為各種組織器官的細(xì)胞,醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”,隨著醫(yī)學(xué)研究不斷深入,干細(xì)胞移植治療已經(jīng)成為解決許多疑難雜癥的首要治療方式。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為臍帶來源的成體干細(xì)胞,具有來源方便、增殖迅速、存活時間長、不受倫理與道德約束等特點,是細(xì)胞替代治療的理想來源。我們前期實驗研究了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞等細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化,但是對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCS)本身的分子調(diào)節(jié)機制暫未有具體的研究。ETV5作為ETS家族轉(zhuǎn)錄因子的一員,文獻(xiàn)報道ETV5在精原干細(xì)胞中能夠調(diào)控BCL6B、LHX1、CXCR4的表達(dá)及癌細(xì)胞中調(diào)控FOXM1的表達(dá)而參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞自我更新、腫瘤形成等過程,所以本實驗旨在前期研究的基礎(chǔ)上,通過電轉(zhuǎn)染方式將ETV5SIRNA轉(zhuǎn)染HUMSCS,研究并探討ETV5在HUMSCS的生物學(xué)功能及其可能的調(diào)控機制。方法通過小塊組織貼壁法培養(yǎng)、擴增HUMSCS,取第三代的HUMSCS,消化、計數(shù)后通過電轉(zhuǎn)染方式以每孔4105細(xì)胞加3UM濃度的ETV5干擾RNA(SIRNA)將其轉(zhuǎn)染HUMSCS并接種到6孔板中,電轉(zhuǎn)染了ETV5SIRNA的HUMSCS為實驗組,僅單純電處理的HUMSCS為對照組,培養(yǎng)箱培養(yǎng)48H后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長融合度、消化計數(shù)并提取RNA,采用QRTPCR檢測HUMSCS的ETV5MRNA表達(dá)情況;QRTPCR檢測BCL6B、LHX1、CXCR4、FOXM1MRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯微鏡下觀察電轉(zhuǎn)染了ETV5SIRNA的HUMSCS培養(yǎng)48H后細(xì)胞生長融合度約65%70,細(xì)胞計數(shù)平均約8105,對照組顯微鏡下觀察細(xì)胞生長融合度約80?,細(xì)胞計數(shù)平均約105105,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P結(jié)論⑴HUMSCS通過電轉(zhuǎn)染ETV5SIRNA干擾ETV5表達(dá),能抑制細(xì)胞增殖,說明ETV5在HUMSCS中能促進(jìn)細(xì)胞增殖。⑵在HUMSCS中,隨著ETV5MRNA表達(dá)下降,BCL6B、FOXM1MRNA表達(dá)水平也下降,而CXCR4、LHX1MRNA表達(dá)水平升高。⑶在HUMSCS中,ETV5可能通過上調(diào)BCL6B、FOXM1表達(dá)而促細(xì)胞增殖,而通過負(fù)性調(diào)控CXCR4、LHX1的表達(dá)參與細(xì)胞的增殖、自我更新和細(xì)胞遷移。
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    • 簡介:學(xué)號201320120廣西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文兩種樹脂基質(zhì)復(fù)合材料對人牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響江新葵導(dǎo)師姓名馮青專業(yè)名稱口腔臨床醫(yī)學(xué)申請學(xué)位類型學(xué)術(shù)型學(xué)位答辯委員會主席鄧旭亮答辯委員會委員程輝趙克莫水學(xué)廖紅兵二○一六年五月兩種樹脂基質(zhì)復(fù)合材料對人牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響2013級碩士畢業(yè)論文簡歷基本情況姓名江新葵性別男民族瑤族出生年月198905籍貫廣西荔浦政治面貌中共黨員學(xué)習(xí)工作經(jīng)歷200809201306廣西醫(yī)科大學(xué)本科學(xué)生201309201606廣西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)生研究生期間科研經(jīng)歷201309201402HU308藥物緩釋涂層對骨質(zhì)疏松大鼠種植體周圍骨組織影響的實驗研究201503201604兩種樹脂基質(zhì)復(fù)合材料對人牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實驗研究
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    • 簡介:目的先天性心臟病CONGENITALHEARTDEFECT,CHD是最常見的嬰幼兒先天畸形,發(fā)病率約為1%~2%,也是嬰幼兒非感染性疾病死亡的最主要原因。由于缺乏特異性早期診斷方法和治療策略相對單一且風(fēng)險大,鑒定CHD相關(guān)易感基因并闡明其作用機理和調(diào)控機制,將具有重要的理論和實踐意義。心臟發(fā)育依賴于不同類型細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞、心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞)的遷移、分化、增殖和凋亡,涉及各種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞黏附分子、信號分子所構(gòu)成的精確而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。上述相關(guān)因素的改變將導(dǎo)致心臟異常發(fā)育而表現(xiàn)為CHD。DICER1基因定位于14Q3213,編碼一種具有1922個氨基酸殘基的核糖核酸酶。DICER1酶能夠識別具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈前體MIRNAPRECURSMIRNA,PREMIRNA或雙鏈RNA(DOUBLESTRRNA,DSRNA),并將其切割成21~23NT的成熟MIRNA或SIRNA。DICER1基因表達(dá)異常與腫瘤、多發(fā)性硬化癥、突發(fā)性聽力喪失等疾病密切相關(guān)。DICER1基因條件性敲除小鼠表現(xiàn)出心臟畸形,但關(guān)于DICER1基因在心臟發(fā)育過程中的具體作用機理及其調(diào)控機制尚不清楚。NFATC3NUCLEARFACTOFACTIVATEDTCELLSC3,NFATC3基因定位于16Q222,編碼產(chǎn)物NFATC3蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子,可以與靶基因調(diào)控序列中NFATC3結(jié)合位點(一致序列為GGAAA)結(jié)合,調(diào)控靶基因的表達(dá)。動物實驗提示NFATC3基因參與正常心臟發(fā)育過程。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件,我們在DICER1基因啟動子區(qū)預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子NFATC3結(jié)合位點。我們推測,NFATC3基因可能調(diào)控DICER1基因參與正常心臟發(fā)育。因此,本研究首先通過檢測DICER1SHRNA對大鼠心肌細(xì)胞H9C2生物學(xué)特性的影響,明確DICER1基因表達(dá)降低導(dǎo)致心臟畸形的可能作用機理其次通過染色質(zhì)免疫沉淀(CHROMATINIMMUNOPRECIPITATION,CHIP)、螢光素酶報告系統(tǒng)、RNA干擾(RNAINTERFERENCE,RNAI)等功能研究,闡明NFATC3基因?qū)ICER1基因的調(diào)控作用及其對大鼠心肌細(xì)胞H9C2生物學(xué)特性的影響,為揭示DICER1基因及其調(diào)控基因NFATC3在心臟發(fā)育過程中的作用提供理論依據(jù)。方法一、實驗材料1、細(xì)胞株大鼠心肌細(xì)胞H9C22、組織標(biāo)本10例心肌組織標(biāo)本由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院提供,標(biāo)本采集均已簽署知情同意書,并經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)通過。二、實驗方法1、DICER1基因RNA干擾實驗DICER1SHRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9C2,REALTIMEPCR和WESTERNBLOT檢測DICER1基因表達(dá)。2、DICER1SHRNA對大鼠心肌細(xì)胞H9C2生物學(xué)特性的影響CCK8活細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞增殖率,WESTERNBLOT分析PCNA表達(dá)水平PI單染法測定細(xì)胞周期,WESTERNBLOT分析CYCLINE1和CYCLINA表達(dá)水平ANNEXINⅤAPCPI方法檢測細(xì)胞凋亡,WESTERNBLOT分析CASPASE3表達(dá)水平。3、DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結(jié)合位點的鑒定生物信息學(xué)軟件預(yù)測DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結(jié)合位點,CHIP實驗鑒定NFATC3與DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結(jié)合位點的特異性結(jié)合共轉(zhuǎn)染NFATC3SIRNA和DICER1基因啟動子區(qū)螢光素酶重組載體PDICER1,應(yīng)用螢光素酶活性檢測系統(tǒng)分析螢光素酶活性,驗證NFATC3與DICER1基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合。4、心肌組織NFATC3基因、DICER1基因表達(dá)分析在10例心肌組織中,WESTERNBLOT檢測NFATC3蛋白表達(dá),REALTIMEPCR檢測DICER1MRNA表達(dá),并進(jìn)行相關(guān)性分析。5、NFATC3基因RNA干擾實驗NFATC3SIRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌細(xì)胞H9C2,WESTERNBLOT檢測NFATC3蛋白表達(dá),REALTIMEPCR和WESTERNBLOT分析DICER1基因表達(dá)水平。6、NFATC3SIRNA對大鼠心肌細(xì)胞H9C2生物學(xué)特性的影響CCK8活細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞增殖率,WESTERNBLOT分析PCNA表達(dá)水平PI單染法測定細(xì)胞周期,WESTERNBLOT分析CYCLINE1和CYCLINA表達(dá)水平ANNEXINⅤFITCPI方法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果1、DICER1SHRNA能夠有效抑制DICER1基因表達(dá)與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染DICER1SHRNA3D后,DICER1基因MRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降79%和54%P<005。2、DICER1基因表達(dá)降低能夠抑制心肌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染DICER1SHRNA3D后,活細(xì)胞數(shù)顯著減少,細(xì)胞增殖抑制率為3186±002%,PCNA表達(dá)降低31%P<005。3、DICER1基因表達(dá)降低使細(xì)胞周期重新分布,阻滯于S期與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染DICER1SHRNA4D后,G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少,所占百分比為6321±282%P<005,而S期細(xì)胞數(shù)顯著增多,所占百分比為2122±60%,CYCLINE1表達(dá)升高35%,CYCLINA表達(dá)降低32%P<005。4、DICER1基因表達(dá)降低能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染DICER1SHRNA4D后,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為1304±30%,CASPASE3表達(dá)升高16%P<005。5、NFATC3能夠與DICER1基因啟動子區(qū)NFATC3結(jié)合位點特異性結(jié)合生物信息學(xué)軟件在DICER1基因啟動子區(qū)預(yù)測到3個潛在的NFATC3結(jié)合位點,CHIP實驗在體內(nèi)鑒定NFATC3能夠與DICER1基因啟動子區(qū)476~472BP處NFATC3結(jié)合位點特異性結(jié)合螢光素酶報告系統(tǒng)證明轉(zhuǎn)錄因子NFATC3可與DICER1基因啟動子區(qū)特異性結(jié)合并影響DICER1基因轉(zhuǎn)錄活性。6、心肌組織中NFATC3基因與DICER1基因表達(dá)呈正相關(guān)NFATC3蛋白和DICER1MRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)R067,P<005。7、NFATC3基因正調(diào)控內(nèi)源性DICER1基因表達(dá)與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染NFATC3SIRNA2D后,NFATC3蛋白表達(dá)水平下降73%P<005,DICER1基因MRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降64%和49%(P<005)。8、NFATC3基因表達(dá)降低能夠抑制心肌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染NFATC3SIRNA3D后,細(xì)胞增殖抑制率為1586±002%,PCNA表達(dá)降低29%P<005。9、NFATC3基因表達(dá)降低使細(xì)胞周期重新分布,阻滯于S期與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染NFATC3SIRNA3D后,G1期細(xì)胞數(shù)顯著減少,所占百分比為5380±46%P<005,而S期細(xì)胞數(shù)顯著增多,所占百分比為3010±410%,CYCLINE1表達(dá)升高15%,CYCLINA表達(dá)降低21%P<005。10、NFATC3基因表達(dá)降低不影響心肌細(xì)胞凋亡與轉(zhuǎn)染NEGATIVECONTROL相比,轉(zhuǎn)染NFATC3SIRNA3D后,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為037±012%P>005。結(jié)論1、DICER1基因表達(dá)降低能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,抑制心肌細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期重新分布、阻滯于S期。2、NFATC3基因表達(dá)降低能夠抑制心肌細(xì)胞增殖,使細(xì)胞周期重新分布、阻滯于S期。3、NFATC3基因靶向正調(diào)控DICER1基因表達(dá)。
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    • 簡介:流體黏性的檢測在生物醫(yī)學(xué),化學(xué),材料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。例如,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,基礎(chǔ)及臨床研究顯示體液黏性與許多疾病密切相關(guān)心腦血管病患者與正常人相比,血液表觀黏度有顯著的變化;退行性關(guān)節(jié)病,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病引起關(guān)節(jié)滑膜液的黏性改變等。目前許多研究涉及到各種類型的生物體液,例如小型動物體液獲取困難,代價很高,降低黏性檢測中的樣品消耗尤為重要。另一方面,黏度也可能影響到腫瘤細(xì)胞的黏附行為。黏度是微粒分散體系中粒子的沉降速率的決定因素之一,對于多相流體,當(dāng)微粒的密度大于分散介質(zhì)的密度,就會發(fā)生沉降,根據(jù)STOKES定律,黏度越大,沉降速度越小,懸浮液中的粒子越穩(wěn)定,越不易發(fā)生沉降。而腫瘤細(xì)胞在血管壁的黏附可以簡化成一個粒子在血液中沉降與管壁接觸黏附的過程,在這一過程中,黏度可能影響到血流中接觸到管壁的腫瘤細(xì)胞數(shù),因此,黏度對腫瘤細(xì)胞黏附行為的影響是值得考察的。此外,由于微流控裝置具備微型化、集成化的優(yōu)勢,近年來被廣泛應(yīng)用在生物技術(shù),化學(xué)化工等領(lǐng)域。如何在微小的芯片內(nèi)精確地掌控流體的運動形態(tài)是微流控技術(shù)的最為基礎(chǔ)而重要的一環(huán)。而黏度,作為一項基本的流變學(xué)參數(shù),對分析流體的運動行為是極為關(guān)鍵的。因此,為了滿足微流控實驗微量化的樣品需求,高效的測量實驗所涉及的流體黏度便成為現(xiàn)代黏性測量技術(shù)的主要課題之一。然而,現(xiàn)有微試樣黏度計的研究面臨著一些瓶頸(1)由于尺度的縮小,末端效應(yīng)、表面張力等在宏觀尺度下可忽略的效應(yīng)陡然增大,并導(dǎo)致了顯著的誤差。這使得現(xiàn)有微試樣黏度計的測量準(zhǔn)確度普通較低,尤其是在低剪切率的條件下測量低黏度的樣品時這一問題尤為突出(誤差5%24)。(2)盡管現(xiàn)有的微試樣黏度計芯片本身樣品容積量很小,但為了驅(qū)動流體進(jìn)行檢測,需要連接容積量很大的泵和導(dǎo)管,因此總的樣品消耗量仍然居高不下。(3)同樣由于尺度的縮小,通道的表面粗糙度過大會給流動造成明顯的擾動導(dǎo)致宏觀流體力學(xué)的失效。因此,微試樣黏度計的制作需要嚴(yán)格控制通道的表面粗糙度,要求更為嚴(yán)格的制作工藝,這使得系統(tǒng)搭建及制作成本很高。(4)由于芯片體積小樣品少,熱容量小,對環(huán)境溫度變化特別敏感,這對測量環(huán)境的溫度控制提出了更嚴(yán)格的要求。而現(xiàn)有的微試樣黏度計未能很好地解決這一問題?;谏鲜鲈?,現(xiàn)有的微試樣黏度計一直未能得到商業(yè)化的運用。因此,提供更加精確、穩(wěn)定、微試樣的黏性測量方法,為科研工作者提供可靠的流體黏度數(shù)據(jù),是論文所需完成的主要目標(biāo)。本文提出了一種高效、精確、微試樣低成本的微流控黏性檢測芯片(后簡稱為芯片黏度計),可以用于生物類流體的黏度測量。在對末端效應(yīng)、表面張力、動能修正項等引入的誤差進(jìn)行評估后,研究者對芯片的構(gòu)型及尺寸進(jìn)行了優(yōu)化通道的兩端加入了一對匹配的光滑圓管,幾乎完全避免了表面張力的影響。芯片的尺寸通過誤差分析決定,優(yōu)化后的芯片誤差被嚴(yán)格控制在05以下,且每次測量消耗量僅為200ΜL。本文采用自制的配套模具,結(jié)合抽絲法,能夠輕易地在芯片內(nèi)部形成表面光滑的圓管,適應(yīng)了通道表面粗糙度需要嚴(yán)格控制的加工需求。為了保證測量環(huán)境的溫度恒定,本文為芯片黏度計設(shè)計了一套專門的測量平臺。測試時,芯片置于特制的恒溫水浴槽中,樣本流體加載于芯片的上游儲液池中,被外部壓力控制裝置驅(qū)動,樣品通過主通道后流入到下游儲液池中。測試流體在黏度測量芯片內(nèi)的流動狀態(tài)通過CCD對儲液池的液面流動情況進(jìn)行記錄,并利用一段圖像處理程序?qū)σ曨l進(jìn)行處理。通過程序自動提取運動軌跡信息、自動輸出黏度值,不但使操作更簡單,又減少了人為因素引入的誤差,使測量結(jié)果具有良好的復(fù)現(xiàn)性。相較于其他微試樣黏度計,本文研制的芯片黏度計結(jié)果更加準(zhǔn)確通過將本文所研制的芯片黏度計與美國國家標(biāo)準(zhǔn)局(NIST)公布的參考值,傳統(tǒng)毛細(xì)管黏度計,傳統(tǒng)旋轉(zhuǎn)黏度計進(jìn)行橫向比對,可以看出芯片黏度計的測量結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值、傳統(tǒng)烏氏黏度計測量值三者吻合良好,相對誤差小于2。本文還根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化組織以及國際電工委員會(ISOIEC)發(fā)布的測量不確定度評估指南對芯片黏度計進(jìn)行完整的不確定度評估,計算其擴展相對不確定度U9522,較主流的微試樣黏度芯片準(zhǔn)確度提高了2倍以上。在芯片黏度計制作完成后,本論文為了考察黏度與腫瘤細(xì)胞黏附行為的關(guān)系,本文還設(shè)計構(gòu)建了一個理想化的HEPG2細(xì)胞黏附模型,用于模擬腫瘤細(xì)胞在人體血管環(huán)境里的黏附行為。在此模型中,本文綜合考慮了黏度、流場等力學(xué)因子對腫瘤細(xì)胞黏附行為產(chǎn)生的影響。首先,本文通過有限元分析預(yù)測了芯片模型中的流場、紊流分布強度等信息,在此基礎(chǔ)上,我們通過三組對比實驗考察了黏度、細(xì)胞密度以及它們與流場之間的相互作用對芯片底面HEPG2細(xì)胞黏附數(shù)量產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果表明,當(dāng)血管分岔角增大時,紊流強度也增大。流場中紊流的增加能有效的提高芯片底面黏附的HEPG2細(xì)胞數(shù)量,但黏附細(xì)胞的總數(shù)受芯片底部管壁容納極限的影響,因此紊流強度達(dá)到一定程度后,黏附細(xì)胞數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定不再繼續(xù)增大。增加細(xì)胞密度相當(dāng)于增加細(xì)胞與底面接觸的幾率,也能起到增加底面黏附細(xì)胞數(shù)的效果,其作用效果在低紊流環(huán)境下格外顯著。而流體黏度對底面黏附細(xì)胞數(shù)的影響較為復(fù)雜,對于不同紊流環(huán)境其效果相差較大,一方面黏度增大了流動阻力,降低了HEPG2細(xì)胞的移動速度,增加了HEPG2細(xì)胞在底面黏附的可能性;另一方面,黏度的增加降低了HEPG2的沉降速度,更多的HEPG2懸浮在溶液中,不與管壁接觸。因此,在黏附能力較弱的低紊流環(huán)境下,這兩個因素互相抵消,黏附細(xì)胞數(shù)保持穩(wěn)定。而在黏附能力較強的高紊流環(huán)境里,后者的影響占主要,因此黏度增加,芯片底部的黏附細(xì)胞數(shù)大幅度降低。實驗結(jié)果與我們的預(yù)期吻合較好。本文所研制的芯片黏度計還具有樣品消耗量小,制造簡單,成本低廉,操作方便且易于維護(hù)的優(yōu)勢。它基于抽絲法構(gòu)建,與傳統(tǒng)的軟蝕刻技術(shù)相比,不需要依賴各種昂貴設(shè)備和器材。僅利用微絲和自制的配套模具,將毛細(xì)管,儲液池,壓力接口全部整合于一塊芯片中,一方面大幅度的降低了制造成本,另一方面又避免了各部件的連接和密封不良可能導(dǎo)致的漏液,減少了連接部位產(chǎn)生的壓降損失從而降低了誤差。由于價格低廉,它可以作為一次性用品以避免芯片之間的樣品污染,也可以多次清洗重復(fù)使用進(jìn)一步降低成本。本黏性測量芯片為微試樣生物流體的精確測量提供了一種新的途徑,可以在生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)化工等領(lǐng)域代替烏氏黏度計執(zhí)行其無法完成的黏性測量,為芯片內(nèi)流動分析、力學(xué)模擬及流動控制等提供精確可靠的流動參數(shù),在生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)化工、材料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
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    • 簡介:大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中圖分類號密級ELF4G1對非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)功能影響的研究FUNCTIONALROLEOFEUKARYOTICTRANSLATIONINITIATIONFACTOR4GAMMA1EIF4G1INNSCLC曹月譽目幾置計學(xué)位論文51頁表格4個插圖16幅指導(dǎo)教師秦智強教授申請學(xué)位級別碩士學(xué)位學(xué)科專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)培養(yǎng)單位大連醫(yī)科大學(xué)研究生院完成時間二。一六年三月答辯委員會主席毒瓣關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說明本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)大連醫(yī)科大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于請在以下相應(yīng)方框內(nèi)打“、/’’1保密口,在年解密后適用本授權(quán)書。2不保密口。作者簽名\耪】;L瓠導(dǎo)師簽名磊澆‰|~日期弘F‘年5月26日日期五心年5月磊日
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    • 簡介:背景自從間充質(zhì)干細(xì)胞于1966年被FRIEDENSTEIN從骨髓中發(fā)現(xiàn)開始越來越多的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的條件下具有向內(nèi)、中、外三個胚層分化的能力其中包括分化為骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的潛能可以廣泛參與組織器官損傷的修復(fù)過程成為組織工程和干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱點。其中骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCS憑借易于培養(yǎng)擴增、遺傳背景相對穩(wěn)定且多向分化特性不受影響等特性被廣泛用于細(xì)胞及組織多種疾病的替代治療。但隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)成年動物骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量及增殖、分化潛能隨年齡的增大而不斷下降且供者間充質(zhì)干細(xì)胞的采集須行骨髓穿刺術(shù)由于疾病的原因病人常有感染、體質(zhì)較弱等因素也限制了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的廣泛應(yīng)用。因此尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞來源是近年來國內(nèi)外干細(xì)胞研究的熱點之一。1991年MCELREAVEY等首次報道從人臍帶的WJ組織中分離并培養(yǎng)到了一種成纖維樣細(xì)胞具有較高的分化潛能。隨后數(shù)位研究者也分別報道從WJ中分離到豐富的MSCS。通過大量體外誘導(dǎo)實驗證實特定條件下其同樣具有成骨、成軟骨、成脂肪、成肌肉、成血管內(nèi)皮、成神經(jīng)細(xì)胞等多向分化能力通過和其他來源MSCS特別是和作為MSCS金標(biāo)準(zhǔn)的BMSCS相比臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有巨大優(yōu)勢首先來源廣泛取材方便供者無痛苦;其次相對純凈污染機會少;第三含量豐富較為原始增殖分化能力強免疫原性低生物性能穩(wěn)定可以為實驗和臨床提供充足的細(xì)胞來源。因此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代來源成為近來基礎(chǔ)研究與臨床廣泛研究的熱點??蒲腥藛T和公眾均寄希望通過間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域的研究治愈諸如難愈性創(chuàng)面多臟器損傷心肌梗死等傳統(tǒng)方式治療效果欠佳的疾病。盡管目前間充質(zhì)干細(xì)胞治療在臨床上的效果尚未得到完全確證還是有越來越多的國家正加入此項研究。然而間充質(zhì)干細(xì)胞治療要想真正從實驗室走向臨床應(yīng)用還面臨著諸多挑戰(zhàn)尚有很多關(guān)鍵性問題亟待解決。特別是間充質(zhì)干細(xì)胞體外的生物學(xué)特性研究至關(guān)重要是其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)及前提。蛻皮甾酮EDS是一種調(diào)控昆蟲蛻皮過程的激素廣泛存在于眾多植物類群及動物類群中結(jié)構(gòu)類似于雌二醇實驗證實其能夠有效促進(jìn)哺乳動物的多種組織和器官的核酸與蛋白質(zhì)的合成及糖和脂類代謝。由于該類物質(zhì)來源廣泛生物學(xué)特性復(fù)雜因此吸引了許多學(xué)者投身其研究工作。OTAKA等報道羥基蛻皮甾酮無論體內(nèi)還是體外實驗均可迅速刺激大鼠肝臟蛋白的合成。體外實驗中羥基蛻皮甾酮能夠通過促進(jìn)合成進(jìn)而增強微粒體和核糖體的蛋白合成能力。YOSHIDAT等報道了蛻皮甾酮對糖代謝的調(diào)節(jié)效應(yīng)預(yù)先腹腔注射羥基蛻皮甾酮能夠?qū)垢骨蛔⑸湟雀哐撬丶办o脈注射抗胰島素引起的高血糖癥。SYROVVN等報道蛻皮甾醇具有保護(hù)肝臟的作用。隨著研究的不斷深入蛻皮甾酮更多的生物學(xué)特性將被揭示出來。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EDS具有促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖促進(jìn)創(chuàng)傷皮膚愈合促進(jìn)表皮及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖等作用。最新研究表明特定條件下甾體類激素地塞米松具有誘導(dǎo)HUCMSCS分化為骨細(xì)胞并表達(dá)骨橋蛋白、涎蛋白、骨連接素等骨性標(biāo)志物的能力且可在黏多糖的基質(zhì)上形成類似于關(guān)節(jié)軟骨的球狀骨針可有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化同屬甾體類物質(zhì)的蛻皮甾酮表現(xiàn)出的生物多效性提示其對促臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)分化等方面有一定的影響最新研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑作用后可有效治療骨質(zhì)疏松等疾病EDS能否誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化尚不明確進(jìn)行此項研究具有廣闊的應(yīng)用前景。目的分離培養(yǎng)并鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS為后續(xù)實驗提供充足的種子細(xì)胞。方法采用酶消化法及組織塊培養(yǎng)法分離出HUCMSCS通過培養(yǎng)、傳代擴增從而獲取相對均一、足夠數(shù)量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。取第3代HUCMSCS通過細(xì)胞流式學(xué)檢測對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105及多向分化能力加以鑒定。取第3、7代HUCMSCS繪制細(xì)胞生長曲線并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果1HUCMSCS的形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察酶消化法所得細(xì)胞原代接種24H可見有少量細(xì)胞貼壁外觀呈紡錘形和短棒形并可見細(xì)胞核。培養(yǎng)至5D左右細(xì)胞大部為雙突起的長梭形、扁平形生長核仁較前明顯。培養(yǎng)至10D左右細(xì)胞形態(tài)變?yōu)闉榈湫偷某衫w維細(xì)胞形態(tài)當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時予以消化、傳代。傳代培養(yǎng)至P3后可出現(xiàn)明顯的單一細(xì)胞集落。從原代培養(yǎng)來看膠原酶消化法比組織塊培養(yǎng)法的效率更高大約10D就可以進(jìn)行傳代而組織塊培養(yǎng)法要14D才能傳代形態(tài)學(xué)變化及之后的傳代兩者之間沒有顯著性差別。2流式細(xì)胞學(xué)檢測CD34陽性率為754%CD45陽性率為535%CD29陽性率為9845%CD44陽性率為9783%CD90陽性率為9736%CD105陽性率為9920%3HUCMSCS體外多向誘導(dǎo)分化31HUCMSCS成骨誘導(dǎo)的形態(tài)變化及功能鑒定成骨誘導(dǎo)5D左右細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槿切位蚨嘟切蔚?。高倍顯微鏡下觀察可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含顆粒樣物質(zhì)。誘導(dǎo)10D細(xì)胞胞質(zhì)中及胞質(zhì)外均可見較多細(xì)小黑色顆粒胞核顏色較淡胞質(zhì)色變深。3W時細(xì)胞生長密集中央可見類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu)部分細(xì)胞呈現(xiàn)層疊樣生長。堿性磷酸酶及茜素紅染色顯示強陽性符合成骨細(xì)胞的特征。說明HUCMSCS在體外具有向成骨細(xì)胞分化的潛能。32HUCMSCS成脂誘導(dǎo)的形態(tài)變化及功能鑒定成脂誘導(dǎo)7D左右細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槎讨?;在誘導(dǎo)約14D時細(xì)胞變?yōu)闄E圓形、圓形;20D時胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴形成油紅“O”染色呈強陽性。表明HUCMSCS在體外具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能。4HUCMSCS生長曲線HUCMSCS生長曲線呈“S”形接種后第1~2天為潛伏適應(yīng)期從第3天起細(xì)胞開始增殖并進(jìn)入對數(shù)生長期第5天達(dá)到高峰7天以后進(jìn)入平臺期。根據(jù)生長曲線可知HUCMSCS的群體倍增時間約為24H。增殖曲線顯示本實驗中P3、P7代細(xì)胞增殖速率無顯著差異。結(jié)論1HUCMSCS可通過酶消化法及組織塊培養(yǎng)法體外分離、純化培養(yǎng)細(xì)胞生長穩(wěn)定可連續(xù)傳代。組織塊培養(yǎng)法的原代培養(yǎng)時間為14~16D培養(yǎng)時間較長而采用膠原酶消化法可快速獲得大量貼壁生長的MSCS且操作簡便易行可更好地保持細(xì)胞活力大大縮短了原代培養(yǎng)時間。2經(jīng)流式紐胞儀檢測HUCMSCS均一地高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD29、CD44、CD90、CD105陰性表達(dá)造血系標(biāo)志CD34、CD45本實驗結(jié)果表明HUCMSCS與其他組織來源的MSCS流式檢測表型一致。3經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后通過ALP染色以及茜素紅染色證實分化為成骨細(xì)胞通過油紅“O”染色證實分化為脂肪細(xì)胞實驗證實分離所得HUCMSCS具有多向分化能力。4HUCMSCS隨著傳代次數(shù)增加增殖能力未見顯著降低。目的觀察凍存復(fù)蘇后人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS的復(fù)蘇率及增值活性探討液氮長期保存間充質(zhì)細(xì)胞的可行性。方法參照前面方法體外分離培養(yǎng)獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞采用改良分階段凍存方法5個月后復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)觀察比較各實驗組細(xì)胞成活率和MTT法檢測細(xì)胞增值能力的差異流式細(xì)胞儀檢測凍存細(xì)胞的表型變化。結(jié)果1復(fù)蘇HUCMSCS的形態(tài)學(xué)特征。復(fù)蘇后細(xì)胞2H即開始貼壁逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮渭岸嘟切?。?fù)蘇細(xì)胞一周左右即可傳代傳至第3代時細(xì)胞形態(tài)與正常培養(yǎng)對照組無明顯差別。2流式細(xì)胞檢測復(fù)蘇HUCMSCS符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。MTT法檢測顯示低溫凍存并沒有降低間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性。結(jié)論通過檢測凍存復(fù)蘇細(xì)胞的存活率臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志未發(fā)生改變表明液氮凍存法可長期保存間充質(zhì)干細(xì)胞;另外恰當(dāng)選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞凍存且凍存細(xì)胞濃度應(yīng)達(dá)到1106ML對于保證凍存成功同樣起著關(guān)鍵作用。目的觀察蛻皮甾酮ECDYSTERONEEDS對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS體外增殖的影響并探討其促進(jìn)細(xì)胞增殖的可能機制。方法取第3代HUCMSCS分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基低糖DMEM培養(yǎng)基、10%的胎牛血清、100UM青鏈霉素、4MMOLLL谷氨酰胺中加入不同濃度0、25、50、100、150、200ΜGMLEDS予以干預(yù)分別于第1、3、5、7天行MTT法檢測細(xì)胞增殖活性;另外設(shè)置相同分組EDS干預(yù)培養(yǎng)HUCMSCS7天繪制細(xì)胞生長曲線觀察比較細(xì)胞增殖差異。經(jīng)細(xì)胞流式儀測定不同分組細(xì)胞周期觀察增殖期細(xì)胞所占比例。對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果1、MTT法檢測結(jié)果顯示經(jīng)EDS干預(yù)培養(yǎng)的HUCMSCS增殖能力較空白對照組有顯著差異P<005其中EDS100ΜGML、150ΜGML及200ΜGML三組細(xì)胞活性比較無顯著差異P>005較其他實驗組有統(tǒng)計學(xué)意義P<005。2、細(xì)胞生長曲線同樣顯示EDS實驗組可有效促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。其中EDS100ΜGML實驗組促增殖效果最明顯EDS100ΜGML、150ΜGML及200ΜGML三組未見顯著性差異。3、流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞周期顯示EDS100ΜGML、150ΜGML及200ΜGML三組細(xì)胞S期細(xì)胞所占比例最大與其他實驗組比較有顯著差異同時三組細(xì)胞的增殖指數(shù)也顯著高于對照組。結(jié)論本實驗證實體外條件下EDS在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)HUCMSCS增殖的作用該作用具有一定的濃度依賴性當(dāng)EDS濃度為100ΜGML促增殖作用達(dá)到最佳效果初步機制認(rèn)為EDS主要是通過改變細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖。目的觀察蛻皮甾酮ECDYSTERONEEDS對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANUMBILICALCDMESENCHYMALSTEMCELLSHUCMSCS成骨分化的影響。方法人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)鑒定取第5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分別在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度EDS和地塞米松予以干預(yù)分別于第1、3、5、7天MTT法檢測細(xì)胞增殖率;另外設(shè)置相同的分組誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后行茜素紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定細(xì)胞成骨分化能力計算陽性細(xì)胞百分比。結(jié)果1MTT檢測顯示一定范圍內(nèi)EDS在基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用濃度增高至200ΜGML對細(xì)胞表現(xiàn)抑制作用地塞米松對細(xì)胞增殖有抑制作用。2茜素紅及堿性磷酸酶鈣鈷法染色鑒定顯示基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞染色陰性EDS及地塞米松組實驗組均可以誘導(dǎo)HUCMSCS鈣化結(jié)節(jié)形成比較發(fā)現(xiàn)EDS200ΜGML組細(xì)胞陽性率與經(jīng)典誘導(dǎo)組無顯著差異P>005EDS200ΜGML組與經(jīng)典誘導(dǎo)組成骨細(xì)胞陽性率均顯著高于EDS100ΜGML組P<001。結(jié)論EDS在濃度200ΜGML時具有誘導(dǎo)HUCMSCS成骨分化的作用但對細(xì)胞增殖抑制作用顯著。初步認(rèn)為EDS通過雌激素受體發(fā)揮此作用。EDS200ΜGML組較EDS100ΜGML組成骨作用差異顯著表明誘導(dǎo)成骨作用具有一定的濃度依賴性。
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      上傳時間:2024-03-07
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    • 簡介:碩士學(xué)位論文槐耳清膏對人肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響槐耳清膏對人肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機制研究及分子機制研究專業(yè)名稱病理學(xué)與病理生理學(xué)專業(yè)代碼100104培養(yǎng)類型學(xué)術(shù)學(xué)位論文編號21400156獨創(chuàng)性聲明獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在指導(dǎo)教師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其它人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得大連醫(yī)科大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名簽字日期年月日
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      上傳時間:2024-03-06
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    • 簡介:南開大學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)電子傳遞及底物作用機制的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究姓名楊文申請學(xué)位級別博士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師饒子和201011中文摘要突變造成329位脯氨酸被強行擠入原底物結(jié)合通道從而有效限制了活性中心的大小,使得該突變體增強了對非天然小分子底物的催化能力。1401P突變體則在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出了許多該野生型蛋白在底物結(jié)合狀態(tài)下所具有的特征提供血紅素鐵原子第六配位鍵水分子的異常;近血紅素一側(cè)的LOOP遠(yuǎn)離活性口袋;I螺旋處殘基265位甘氨酸和266位組氨酸構(gòu)象變化導(dǎo)致的螺旋內(nèi)部氫鍵的斷裂。這種近似底物結(jié)合狀態(tài)下的構(gòu)象為原始底物長鏈飽和脂肪酸的催化提供了極為便利的條件。本論文的研究工作有助于深入理解細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)電子傳遞蛋白相互識別的特異性,小分子底物識別進(jìn)入酶蛋白活性中心的途徑,以及酶蛋白突變體功能和結(jié)構(gòu)的關(guān)系,并為這三方面的進(jìn)一步研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞細(xì)胞色素P450;I類型電子傳遞系統(tǒng);底物進(jìn)入通道;多步結(jié)合機制;定向進(jìn)化;晶體結(jié)構(gòu)Ⅱ
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      上傳時間:2024-03-07
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    • 簡介:分類號分類號R7337密級密級公開公開研究生學(xué)位論文論文題目(中文)論文題目(中文)X射線對肺腺癌射線對肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)特性的作用細(xì)胞生物學(xué)特性的作用論文題目(外文)論文題目(外文)THESTUDYONBIOLOGICALEFFECTSOFLUNGADENOCARCINOMAA549CELLSWITHXRAYSIRRADIATION研究生姓名研究生姓名楊震學(xué)科、專業(yè)學(xué)科、專業(yè)生物科學(xué)生物科學(xué)細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究方研究方向醫(yī)學(xué)與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)醫(yī)學(xué)與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)學(xué)位級別學(xué)位級別碩士導(dǎo)師姓名、職稱導(dǎo)師姓名、職稱王小虎王小虎教授教授論文工作論文工作起止年月起止年月2013年11月至月至2016年6月論文提交日期論文提交日期2016年5月論文答辯日期論文答辯日期2016年5月學(xué)位授予日期學(xué)位授予日期2016年6月校址甘肅省蘭州市校址甘肅省蘭州市蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文X射線對肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)特性的作用IX射線對肺腺癌射線對肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)特性的作用細(xì)胞生物學(xué)特性的作用中文摘要中文摘要目的目的本文主要用0、05、1、2、4和10GY不同劑量的X射線輻照肺腺癌A549細(xì)胞后,研究A549細(xì)胞的凋亡率、粘附性、遷移和侵襲的生物學(xué)特性,初步探討X射線對MMP2MRNA、MMP9MRNA及兩種蛋白表達(dá)水平變化與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能機制。方法方法肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)過不同劑量的X射線輻照后,在不同的時間段用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化;選用MTS法檢測A549細(xì)胞粘性變化;用TRANSWELL小室檢測X射線對A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響變化;提取細(xì)胞中MRNA和總蛋白,用熒光定量PCR法和WESTERNBLOTING檢測MMP2MRNA、最后MMP9MRNA和兩種蛋白的表達(dá)水平的變化。結(jié)果結(jié)果不同劑量的X射線輻照A549細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率隨著輻照劑量增加而相應(yīng)增多,并且在一定時間內(nèi)隨著輻照后時間的延長,凋亡數(shù)也相應(yīng)增加,與輻照劑量和輻照后時間呈相關(guān)性(P<005)。細(xì)胞粘附能力隨著輻照劑量的增加而增強,與對照組0GY相比,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)。遷移試驗結(jié)果表明,在05、1和2GY輻照后,與對照組0GY相比,細(xì)胞遷移率無顯著性差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>005)隨著輻照劑量的增加,在4和10GY時,與對照組0GY相比,細(xì)胞遷移數(shù)顯著下降,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005);細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果與遷移基本一致。熒光定量(RTPCR)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在05、1和2GY的劑量輻照后,與對照組0GY相比,MMP2MRNA、MMP9MRNA表達(dá)量量無顯著差異(P>005),在4和10GY輻照后,于對照組0GY相比,MMP2MRNA和MMP9MRNA表達(dá)量顯著下降,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)。WESTERNBLOTING檢測發(fā)現(xiàn),在05、1和2GY射線輻照后,與對照組0GY相比,MMP2和MMP9蛋白表達(dá)量變化無顯著差異(P>005);輻照劑量增加到4和10GY時,兩種蛋白表達(dá)量與對照組0GY相比有顯著性差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)。結(jié)論結(jié)論肺腺癌A549細(xì)胞經(jīng)過不同劑量的X射線輻照后,細(xì)胞凋亡率與輻照劑量和輻照后培養(yǎng)的時間具有依賴性關(guān)系;不同劑量的X射線在一定的輻照范圍內(nèi),
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      上傳時間:2024-03-08
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    • 簡介:目的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥ALIARDS是各種致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭是臨床常見急重癥其死亡率在20世紀(jì)70年代早期高達(dá)70%以上盡管近年來對其認(rèn)識及救治技術(shù)不斷提高但總體病死率仍然在40%以上。國內(nèi)外學(xué)者對ARDS的治療進(jìn)行了大量研究并取得了一些進(jìn)展但相關(guān)治療策略均只能在一定程度上緩解病情并不能從根本上改善ARDS的不良預(yù)后。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞損傷是ARDS的特征性病理改變因此對受損肺臟進(jìn)行結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能重建才是降低ARDS死亡率的理想治療方式成體干細(xì)胞具有多向或單向分化潛能取材方便易于分離擴增并且不涉及到醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的相關(guān)問題因而在ALIARDS治療中具有重要的應(yīng)用價值。內(nèi)皮祖細(xì)胞EPC是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞并且可參與出生后血管新生、再內(nèi)皮化和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)。鑒于EPC作為內(nèi)源性修復(fù)機制在維持內(nèi)皮細(xì)胞層完整性方面發(fā)揮了重要的作用并且內(nèi)皮受損為ARDS早期的特征性病理改變之一因此EPC移植有希望成為ALIARDS的有效治療手段。本研究旨在了解ARDS動物模型不同發(fā)病階段EPC的動態(tài)變化規(guī)律觀察EPC自體移植以及EPC培養(yǎng)液“無細(xì)胞移植”對ARDS的生物作用并探討其可能的作用機制為提出ALIARDS治療新方法提供實驗線索。方法⑴從兔耳中央動脈抽取外周血10MLKG以密度梯度法分離出單個核細(xì)胞PMC并將其接種于培養(yǎng)皿內(nèi);使用添加了細(xì)胞因子和胎牛血清的內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)液EGM2進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。首次換液時間為72小時其后每48小時換液一次。結(jié)果顯示體外培養(yǎng)24小時后可見到單個核細(xì)胞粘附于培養(yǎng)皿底部。粘在第3天時部分細(xì)胞呈現(xiàn)出紡錘形變化并且細(xì)胞分裂增殖明顯。此時更換培養(yǎng)液以除去未貼壁細(xì)胞和紅細(xì)胞。從第5天起一部分單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為梭形的貼壁細(xì)胞并且隨著體外培養(yǎng)時間的延長圓形細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少而梭形細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多在第7天左右可觀察到成團細(xì)胞形成的細(xì)胞集落。在第14天左右細(xì)胞形狀變?yōu)殚L梭形并且多角形細(xì)胞有融合趨勢吞噬功能和粘附功能實驗顯示體外培養(yǎng)的EPC可同時攝取DIL標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白DILACLDL并粘附FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1FITCUEA1熒光顯微鏡下雙陽性細(xì)胞的比率接近100%通過免疫熒光對表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測顯示95%以上的細(xì)胞同時表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子受體2VEGFR2和CD34。依據(jù)上述條件可認(rèn)定通過密度梯度離心后體外培養(yǎng)擴增的細(xì)胞為早期EPC。⑵通過耳緣靜脈將內(nèi)毒素ET055B5;500ΜGKG和700ΜGKG注入新西蘭大白兔體循環(huán)內(nèi)72小時后活殺各組動物并取肺組織進(jìn)行大體病理觀察對兩組動物的肺組織切片行HE染色顯示兩組動物均表現(xiàn)為不同程度的肺組織充血、微血管內(nèi)皮損傷、出血和以中性粒細(xì)胞浸潤為主的大量白細(xì)胞滲出、聚集;同時兩組動物還出現(xiàn)肺泡間隔增厚、破壞以及部分肺泡萎陷不張等病理改變。上述結(jié)果提示兩組劑量內(nèi)毒素均可成功建立ALI模型。與500ΜGKG劑量組相比700ΜGKG劑量組動物的肺組織損傷程度相對較重但早期死亡率過高不利于進(jìn)行后期分析。因此在后續(xù)實驗中采用內(nèi)毒素500ΜGKG建立ALI動物模型。⑶利用內(nèi)毒素500ΜGKG建立兔ALI模型同時以等量生理鹽水注射設(shè)立對照組。分別在12小時、24小時、48小時、72小時和第5天抽取外周血利用流式細(xì)胞儀測定外周血中VEGFR2和CD34雙陽性細(xì)胞EPC的比率。體外培養(yǎng)細(xì)胞后測定EPC的增殖、粘附和遷移功能。結(jié)果①對照組外周血EPC比率基本保持穩(wěn)定;模型組外周血EPC比率在內(nèi)毒素注射后即出現(xiàn)降低24小時后降至最低點其后有所上升但第5天時仍低于對照組。EPC增值、粘附和遷移功能均在內(nèi)毒素注射后出現(xiàn)降低48小時后降至最低點其后有所上升第5天時仍低于對照組;模型組在各時間點與對照組相比均具有顯著差異。②CMDIL標(biāo)記的EPC可定植于肺組織內(nèi)正常對照組各項指標(biāo)在各時間點均無顯著變化并且與肺損傷對照組和EPC移植組相比均具有顯著差異P005。結(jié)論⑴密度梯度離心聯(lián)合貼壁選擇法能夠成功從外周血中分離中EPC并可在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴增。⑵在內(nèi)毒素構(gòu)建的兔ALI動物模型中外周血EPC數(shù)量以及增殖、粘附和遷徙功能在ALI早期均出現(xiàn)顯著降低;隨著肺部炎癥的消退EPC數(shù)量和相關(guān)功能有所恢復(fù)。⑶來源于外周血的自體EPC于移植后可歸巢到受損肺臟并且可減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷病變嚴(yán)重程度。自體EPC移植可通過降低ICAM1和P選擇素表達(dá)的方式減少ALI起始階段的PMN肺內(nèi)扣押進(jìn)而預(yù)防肺損傷。自體EPC移植可將內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子反應(yīng)部分轉(zhuǎn)化為抗炎細(xì)胞因子反應(yīng)同時可還可通過減少肺組織細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用EPC培養(yǎng)液移植可在一定程度上減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷具有用作輔助治療的潛力同時亦表明EPC旁分泌為EPC治療ALI的作用機制之一。
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    • 簡介:西南醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中圖分類號中圖分類號R89;R36;R39碩士學(xué)位論文LYN在肺腺癌中的表達(dá)及在肺腺癌中的表達(dá)及LYN高表達(dá)對高表達(dá)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響細(xì)胞生物學(xué)行為的影響院(系)、所院(系)、所臨床醫(yī)學(xué)院研究生姓名研究生姓名沈琴琴學(xué)科、專學(xué)科、專業(yè)內(nèi)科學(xué)導(dǎo)師姓導(dǎo)師姓名李國平教授二〇一六年四月二〇一六年四月西南醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文15參考文獻(xiàn)4916英漢縮略詞對照表522致謝533LYN與惡性腫瘤(綜述)54
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    • 簡介:近年來,基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展,加深了人們對腫瘤異質(zhì)性的認(rèn)識,含有大量腫瘤臨床樣本多組學(xué)數(shù)據(jù)庫的TCGA及ONCOMINE分析平臺為腫瘤個體差異的基因分型、治療與生存期的整合研究提供了大樣本數(shù)據(jù)庫,受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,并越來越多地運用到腫瘤的個體化精準(zhǔn)治療的研究中來。肝細(xì)胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMA,HCC是常見的惡性腫瘤之一,現(xiàn)已成為中國第二世界第三位的癌癥死亡原因。中國為肝癌高發(fā)病率國家,手術(shù)切除被認(rèn)為是可能治愈初診HCC患者的療法,但只有約10%~20%的患者腫瘤可切除,且手術(shù)病人面臨腫瘤復(fù)發(fā)的可能,最近的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)2000年至2014年間中國肝癌患者5年生存率僅為141%。近年來針對肝癌靶向治療藥物的研發(fā)逐漸成為熱點,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突變參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展,而其精確的分子機制尚不完全清楚,導(dǎo)致靶向制劑對腫瘤患者個體的治療效果差異大,藥物靶向性較低。目前,作為首個美國FDA批準(zhǔn)上市,用于晚期HCC靶向治療的多激酶抑制劑索拉菲尼,其有效率也僅為25%。1995年LEVER在THELANCET雜志發(fā)表一項大型開創(chuàng)性回顧研究,發(fā)現(xiàn)服用血管緊張素酶抑制劑ANGIOTENSINCONVERTINGENZYMEINHIBITS,ACEIS和血管緊張素受體抑制劑ANGOTENSINRECEPTERBLOCKERS,ARBS的病人比未服用該類藥物的病人患乳腺癌和肺癌的風(fēng)險更低。隨后另一部分的學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究卻未得到類似結(jié)果。這個不同的研究結(jié)果引起眾多學(xué)者的關(guān)注,在這些研究中除了入選患者種族、人群及服藥周期等不同因素外,由于受到基因測序技術(shù)的限制,大部分的患者未做個體基因表達(dá)譜測定,導(dǎo)致患者個體基因差異未做考慮。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn),在腎素血管緊張素系統(tǒng)中一個關(guān)鍵受體AT1RTYPE1ANGIOTENSINⅡ其編碼的基因AGTR1在多個腫瘤中發(fā)生異質(zhì)性表達(dá),并且高表達(dá)該基因會引起多種腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良預(yù)后,但是AGTR1基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及對肝癌的影響卻少有報道。對TCGA數(shù)據(jù)庫中全部3個肝細(xì)胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù)的AGTR1基因表達(dá)與臨床生存期的相關(guān)性進(jìn)行分析,提示AGTR1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了AGTR1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對肝癌影響的研究。第一部分AGTR1差異表達(dá)對肝細(xì)胞癌發(fā)展的影響選用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫中全部3個肝細(xì)胞癌的臨床347例RNA芯片數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)AGTR1基因在這3個數(shù)據(jù)集中均位于過表達(dá)基因前5%,并在部分肝細(xì)胞癌患者中出現(xiàn)高表達(dá)。同時在TCGA數(shù)據(jù)庫中對全部374例的肝細(xì)胞癌臨床樣本進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)AGTR1表達(dá)前80位和后80位的樣本AGTR1的相對表達(dá)具有顯著差異,進(jìn)一步結(jié)合數(shù)據(jù)庫中肝細(xì)胞癌樣本預(yù)后數(shù)據(jù),采用KAPLANMEIER生存分析,發(fā)現(xiàn)低表達(dá)組患者的生存期較高表達(dá)組顯著延長。以上結(jié)果說明,AGTR1在部分肝細(xì)胞癌患者中呈高表達(dá),且這種高表達(dá)與患者的生存期相關(guān),由此初步推斷AGTR1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。為了證明AGTR1基因在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用,篩選低表達(dá)AGTR1的SMMC7721和BEL7404細(xì)胞,對它們進(jìn)行過表達(dá)AGTR1的改造,同時選擇高表達(dá)AGTR1的MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行干擾表達(dá)的改造,體內(nèi)外研究AGTR1對肝細(xì)胞癌的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGTR1在體外實驗中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞侵襲及遷移的作用,而在體內(nèi)試驗中能加速裸鼠皮下成瘤試驗的腫瘤形成及生長。此外,采用含有LUCIFERINE片段的載體構(gòu)建SHAGTR1和SHNC,穩(wěn)篩低表達(dá)AGTR1的MHCC97H細(xì)胞,采用小動物活體成像系統(tǒng),在體觀察不同AGTR1表達(dá)量的MHCC97H細(xì)胞在脾臟肝轉(zhuǎn)移模型中的轉(zhuǎn)移情況,發(fā)現(xiàn)抑制AGTR1可以降低MHCC97H腫瘤細(xì)胞的脾臟肝轉(zhuǎn)移能力。第二部分AGTR1差異表達(dá)影響肝細(xì)胞癌生長的作用機制研究為了探討AGTR1促進(jìn)HCC細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移作用機制,采用WESTENBLOT方法檢測過表達(dá)和干擾表達(dá)AGTR1對HCC細(xì)胞信號通路的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HCC細(xì)胞中的AGTR1可以促進(jìn)JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1則可以降低相應(yīng)分子的磷酸化。且JAK2特異性抑制劑AG490可以抑制AGTR1介導(dǎo)的HCC細(xì)胞的生長、克隆形成、遷移及侵襲能力。此外,先用TCGA數(shù)據(jù)庫中374例肝細(xì)胞癌患者的MRNA芯片數(shù)據(jù),對VEGF與AGTR1進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)隨著AGTR1的表達(dá)量的上升,VEGF與AGTR1表達(dá)相關(guān)性也隨之上升。對低表達(dá)AGTR1的SMMC7721,BEL7404細(xì)胞過表達(dá)AGTR1,兩個細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)也隨著AGTR1的表達(dá)上升而上升。對高表達(dá)AGTR1的MHCC97H細(xì)胞干擾表達(dá)AGTR1,VEGF的表達(dá)也隨之下降,且因AGTR1的高表達(dá)或過表達(dá)引起的VEGFA的上調(diào)表達(dá)可以被AG490抑制。由此可以推斷,AGTR1的高表達(dá)可能會促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)JKA2的磷酸化,進(jìn)而激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)STAT3、ERK等分子的磷酸化,這些磷酸化的分子可進(jìn)入細(xì)胞核,啟動VEGF等分子的轉(zhuǎn)錄、翻譯、合成,促進(jìn)細(xì)胞分泌VEGF等細(xì)胞因子,大量新分泌的VEGF與細(xì)胞表面的受體結(jié)合可能會進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)STAT3、MAPK等信號通路,促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管的生成及細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)過程。第三部分AGTR1抑制劑對HCC細(xì)胞體內(nèi)外抗腫瘤作用效果研究本部分研究中選擇臨床應(yīng)用時間最長、應(yīng)用病例最多的洛沙坦作為靶向AGTR1的抑制劑考察其作用效果。在體外實驗中,發(fā)現(xiàn)當(dāng)洛沙坦?jié)舛葹?~100ΜM時,能夠不同程度的抑制AGTR1高表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞和AGTR1過表達(dá)的SMMC7721細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力,但對AGTR1低表達(dá)的SMMC7721細(xì)胞和AGTR1干擾表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞則無上述作用。體內(nèi)實驗中,選用高表達(dá)AGTR1的MHCC97H細(xì)胞,在裸鼠皮下成瘤模型中,經(jīng)過4周給藥,相比空白對照組,20MGKG1~80MGKG1給藥劑量的洛沙坦能不同程度的抑制裸鼠皮下腫瘤的生長。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的增加,瘤內(nèi)AT1R、VEGFA及CD31蛋白的表達(dá)水平顯著下降,血清VEGFA量也隨著洛沙坦的給藥劑量提高而受到不同程度的抑制。由此考察了洛沙坦在體內(nèi)外水平對AGTR1高表達(dá)HCC細(xì)胞生長及腫瘤血管形成的抑制作用。綜上所述,本課題通過TCGA數(shù)據(jù)庫中全部肝細(xì)胞癌的臨床374例RNA芯片數(shù)據(jù),對AGTR1基因表達(dá)與臨床生存期的相關(guān)性進(jìn)行分析,提示AGTR1在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了AGTR1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對肝癌影響的研究。對6種不同的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HEPG2、BEL7402、BEL7404、SMMC7721、MHCC97H、HLF與正常肝細(xì)胞系QSG7701進(jìn)行AGTR1的MRNA及蛋白的表達(dá)檢測,證實相比正常肝細(xì)胞系QSG7701,肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC97H、HLF中AGTR1MRNA和蛋白水平均有顯著的上調(diào)表達(dá),而在BEL7404、SMMC7721中AGTR1MRNA和蛋白水平的表達(dá)顯著低于正常肝細(xì)胞的表達(dá)水平。通過驗證臨床肝癌樣本中AGTR1的表達(dá)情況,顯示33例肝細(xì)胞癌樣本中有20例臨床樣本AGTR1呈上調(diào)表達(dá)或高表達(dá)。進(jìn)一步通過體內(nèi)外實驗,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AGTR1后可促進(jìn)HCC細(xì)胞體外增殖、克隆形成、細(xì)胞侵襲及遷移能力,加速裸鼠皮下腫瘤形成及生長而抑制AGTR1的表達(dá)可降低HCC細(xì)胞體外增殖、克隆形成、細(xì)胞侵襲及遷移能力,并降低HCC腫瘤細(xì)胞的脾臟肝轉(zhuǎn)移能力。通過對AGTR1相關(guān)通路的分析,揭示AGTR1高過表達(dá)HCC細(xì)胞主要通過JAK2STAT3通路介導(dǎo)其生長、增殖、遷移及侵襲過程,同時驗證了AGTR1靶向抑制劑的作用。在藥效實驗中,探討以AGTR1靶向抑制劑洛沙坦對HCC細(xì)胞的作用效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外試驗中,當(dāng)洛沙坦?jié)舛葹?~100ΜM時,能夠不同程度的抑制AGTR1高過表達(dá)HCC細(xì)胞的體外增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力。在體內(nèi)實驗的裸鼠皮下成瘤模型中,經(jīng)過4周給藥20MGKG1~80MGKG1,洛沙坦能顯著抑制AGTR1高表達(dá)HCC細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤的生長,降低腫瘤組織中AGTR1、VEGFA及CD31蛋白表達(dá)。由此證明了洛沙坦在體內(nèi)外水平具有抑制AGTR1高表達(dá)HCC細(xì)胞生長的作用。研究結(jié)果明確了AGTR1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,探討了AGTR1促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞異常生長的可能機制,為AGTR1高表達(dá)肝細(xì)胞癌靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用提供了實驗數(shù)據(jù)。
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